不同劑量辛伐他汀對慢性心房重構(gòu)犬心房肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

王 健 龐軍濤

1.山東省濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東濰坊 261041

心房重構(gòu)概念的確立是對房顫（AF）病理生理認(rèn)識的重大進(jìn)步，為AF的預(yù)防和治療提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心房重構(gòu)的重要分子機(jī)制。本研究利用快速心房起搏所致犬慢性心房重構(gòu)模型觀察不同劑量辛伐他汀對慢性心房重構(gòu)犬心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響，揭示他汀類藥物劑量與鈣超載抑制效應(yīng)的關(guān)系，為他汀類藥物干預(yù)心房重構(gòu)及抗心律失常作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

28只健康雜種犬均購自濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，雌雄不限，體重8～11.5 kg。將其隨機(jī)分成4組：對照組，起搏組，干預(yù)1組，干預(yù)2組，每組各7只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 實(shí)驗(yàn)動物用3%戊巴比妥鈉麻醉（30 mg/kg）。采用右側(cè)開胸法暴露右心房。將起搏電極縫于右心耳，電極導(dǎo)線由皮下竇道引至頸部傳出備用。術(shù)后第2天起，干預(yù)1組喂服默沙東制藥有限公司生產(chǎn)的辛伐他汀（批號 S1203）10 mg/d，干預(yù) 2組60 mg/d。術(shù)后第6天開始以480次/min的頻率通過備用電極快速起搏右心房（對照組只手術(shù)不起搏）。連續(xù)刺激6 d后，取各組犬右心房組織，測定心房肌細(xì)胞游離鈣濃度

1.2.2 測定游離鈣濃度 采用美國Sigma公司分裝的胰蛋白酶分解法獲得心房肌細(xì)胞懸液。以4℃預(yù)冷PBS液洗去所取犬右心耳組織血液，將組織剪碎，放入含有0.25%胰蛋白酶溶液的培養(yǎng)皿中，置于37℃溫箱中消化40 min。2000 r/min離心 15 min，棄去上清液，加入 D-Hank′s液，吹打，離心，棄去上清液，吹勻沉淀細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液。取適量懸液于印孔載玻片上加入稀釋后的美國Biotium公司生產(chǎn)的Fluo-3/Am 20 μL，37℃避光孵育 30min。利用德國ZEISS公司生產(chǎn)的共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。發(fā)射波長520 nm，激發(fā)波長488 nm。計算細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越大，表示細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度越高，反之則濃度越低。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較的SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1a～d依次為對照組、起搏組、干預(yù) 1組、干預(yù)2組共聚焦顯微鏡下的單個心房肌細(xì)胞，綠色熒光代表細(xì)泡內(nèi)游離Ca2+濃度（圖1，見封三）。起搏組犬心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度高于對照組（P＜0.01）、干預(yù)1組（P ＜ 0.05）、干預(yù) 2組（P ＜ 0.01）明顯增加；干預(yù) 1組犬心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度高于對照組（P＜0.05）和干預(yù)2組（P＜0.05）；對照組和干預(yù) 2組犬心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、2。

表1 對照組與起搏組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的比較（±s）

表1 對照組與起搏組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的比較（±s）

組別 例數(shù)（只） 熒光強(qiáng)度 P值對照組7109.0±17.60＜0.01起搏組7162.0±18.40

表2 起搏組與干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比較

圖1 各組細(xì)泡內(nèi)游離鈣濃度（150×）（見內(nèi)文第37頁）

3 討論

心房重構(gòu)已是公認(rèn)的是AF發(fā)生維持的病理生理基礎(chǔ)，這為臨床AF的藥物治療提供了新的目標(biāo)——藥物預(yù)防心房重構(gòu)。盡管具有很大的潛在價值，目前尚未找到安全有效的防治慢性心房重構(gòu)的臨床用藥。尋找實(shí)用有效的臨床能夠防治慢性心房重構(gòu)的藥物已成為AF防治中的迫切任務(wù)。

心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心房重構(gòu)的重要分子機(jī)制[1]。Leistad等[2]在誘發(fā) AF 25 min后，采用熒光法測定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加1倍?？焖傩姆看碳な故湛s期相對延長，通過L型Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+增加，誘發(fā)肌漿網(wǎng)釋放 Ca2+，即 Ca2+誘發(fā) Ca2+釋放，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷。Asuma等[3]通過電鏡研究了與時間相關(guān)的鈣分布的改變。結(jié)果提示鈣的超載會持續(xù)至少2周。Ica在調(diào)節(jié)人類心房頻率依賴性的心房肌動作電位時程（APD）和心房有效不應(yīng)期（AERP）的變化中起重要作用，是參與心房電重構(gòu)的主要離子通道[4]?？焖傩姆看碳な故湛s期相對延長，通過L型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 Ca2+增加，誘發(fā)肌漿網(wǎng)釋放 Ca2+，即 Ca2+誘發(fā)Ca2+釋放，使細(xì)胞內(nèi)鈣超載。細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加對L型Ca2+通道活性的負(fù)反饋?zhàn)饔檬笴a2+電流減低，導(dǎo)致心房肌不應(yīng)期和動作電位時間縮短及動作電位平臺相消失，因此，細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能是AF電重構(gòu)的始動因素。鈣作為信號傳遞系統(tǒng)的重要組分也是引起AF時心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要因素之一。Brundel等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AF時心房肌細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞槳和閏盤鈣水平增加，激活鈣激活蛋白酶Ⅰ。鈣激活蛋白酶的激活與心房ERP縮短，心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變以及通道蛋白含量降低有關(guān)。L-型鈣通道蛋白質(zhì)表達(dá)減少與心房收縮功能不全有關(guān)[6]。Lu等[7]通過研究證實(shí)犬AF模型的microRNA-328表達(dá)增高3.7倍，通過其靶基因CACNA1C和 CACNB1基因調(diào)控 L型 Ca2+通道的兩種亞基蛋白，并通過對L型Ca2+流產(chǎn)生影響達(dá)到縮短動作電位時程而參與AF的電重構(gòu)。AF時鈣超載引起的心房收縮功能降低能導(dǎo)致心房肌被動延展，心房擴(kuò)大進(jìn)一步促進(jìn)AF發(fā)生，引起惡性循環(huán)。

辛伐他汀可以影響細(xì)胞膜鈣電流和細(xì)胞內(nèi)游離鈣[8-9]。該研究利用快速起搏制備的犬慢性心房重構(gòu)模型近一步觀察辛伐他汀劑量與其抑制鈣超載作用之間的關(guān)系。結(jié)果證實(shí)辛伐他汀對快速心房起搏引起的心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載抑制作用的強(qiáng)弱，與藥物劑量相關(guān)。盡管常規(guī)劑量的辛伐他汀（干預(yù)1組）已經(jīng)具備抑制心動過速心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載作用，進(jìn)一步增加辛伐他汀劑量后，這種作用愈加明顯。結(jié)果顯示喂服辛伐他汀60 mg/d的實(shí)驗(yàn)犬在連續(xù)快速刺激6 d后，其心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度與對照組沒有明顯差異。提示他汀類藥物發(fā)揮充分抗心律失常作用可能需要超常規(guī)的劑量，所以其臨床的適用性尚需要更多的研究論證。

羥甲基戊二酰輔酶 A（HMGCoA）還原抑制劑作為能改善心血管病患者預(yù)后的調(diào)脂藥，除能有效降脂外，還具有多向效應(yīng)，其原因很大程度上是因?yàn)榱u甲基戊二酰輔酶還原抑制劑對細(xì)胞膜離子通道的影響。既往基礎(chǔ)研究證實(shí)辛伐他汀可抑制AngⅡ引起的細(xì)胞內(nèi)瞬時鈣電流峰值，降低因AngⅡ引起的鈣電流增加[9]。而且大劑量的辛伐他汀可以抑制長期心動過速所致犬心房肌細(xì)胞ⅠCa α-亞單位蛋白的變化，抑制心動過速對AF的促發(fā)作用[10]。普伐他汀能夠逆轉(zhuǎn)快速起搏心房引起的電重構(gòu)，可能的機(jī)制是普伐他汀能夠增強(qiáng)ⅠCa的作用進(jìn)而延長動作電位時程[11]。本研究證實(shí)辛伐他汀可以抑制持續(xù)心動過速造成的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，大劑量使用比臨床常用劑量的效果更為明顯，這可能是其影響心房重構(gòu)的分子機(jī)制之一。辛伐他汀對心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載的抑制作用可能是其臨床應(yīng)用中降低AF發(fā)生率效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。另外他汀類藥物的抗炎抗氧化作用也是其抗心房重構(gòu)作用的可能機(jī)制。

綜上所述，辛伐他汀是一種值得進(jìn)一步探討的以抗心房重構(gòu)為目標(biāo)的AF治療藥物，期待更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究確定其在AF防治中的效應(yīng)和價值。

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