精索靜脈曲張不育癥患者精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的測(cè)定與分析

覃 湛 袁逸之 袁少英 胡曉瑩 金明昱 耿立果

1.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院男科，廣東珠海 519015；2.北京師范大學(xué)-香港浸會(huì)大學(xué)聯(lián)合國際學(xué)院，廣東珠海 519085

WHO把精索靜脈曲張（varicocele，VC）列為男性不育的首位原因[1]，在不育男性中發(fā)病率高達(dá) 25%-40%。有很多研究表明VC不育癥與睪丸局部溫度過高、精索靜脈內(nèi)壓力增高、睪丸局部缺氧與pH值改變、腎上腺和腎靜脈內(nèi)的物質(zhì)反流等因素有關(guān)，但確切原因未明確。由于精漿含有維持精子生存的各種營養(yǎng)成分，又是精子運(yùn)動(dòng)的必需介質(zhì)；精子頂體酶是參與精子穿透卵子透明帶的頂體反應(yīng)中最重要的酶，因此，VC與精子的活動(dòng)力、受精能力密切相關(guān)。本研究檢測(cè)了VC不育癥患者的精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的活性，為探討VC不育癥的發(fā)病機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者來源于2011年5月～2013年5月在廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院男科門診就診的不育癥患者，隨機(jī)選取VC不育癥精液參數(shù)異常者（A組）136例，生殖系統(tǒng)感染性不育癥但無VC且精液參數(shù)異常者（B組）34例，有VC精液參數(shù)正常者（C組）35例，另取無 VC且精液參數(shù)正常并已生育的體檢健康者（D組）35例設(shè)為正常對(duì)照組。其中A組又根據(jù)VC的程度分為A1組（Ⅰ度）34 例、A2 組（Ⅱ度）35 例、A3 組（Ⅲ度）35 例、A4組 （亞臨床型）32例，A組患者年齡平均 （33.17±3.83）歲，A1 組平均（33.86±2.16）歲，A2 組平均（34.21±4.23）歲，A3 組平均（33.21±2.39）歲，A4 組平均（32.93±4.63）歲，B 組平均（34.16±4.52）歲，C 組平均（33.81±4.01）歲，D 組平均（32.68±4.29）歲。 各組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均有可比性。精索靜脈曲張程度可根據(jù)觸診與彩超檢查結(jié)果分為四度：Ⅰ度：觸診不明顯，但Valsava方法檢測(cè)陽性；Ⅱ度：觸診時(shí)容易觸及擴(kuò)張的靜脈，但不易看見；Ⅲ度：能看見擴(kuò)張的靜脈成蚯蚓團(tuán)突出在陰囊表現(xiàn)，容易摸到；亞臨床型：觸診不明顯，Valsava方法檢測(cè)陰性，但彩超可見靜脈反流[2]。本研究課題經(jīng)廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審閱并通過，所有納入的研究對(duì)象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 診斷及選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照WHO《人類精液及精子—宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》（第5版）、《不孕與不育》[2]制訂：①夫妻同居1年以上，性生活正常而未孕。②精子濃度＜15×106/mL；前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）＜32%。③陰囊下墜，青筋暴露，盤曲甚者觸之蚯蚓團(tuán)，睪丸或腹股溝疼痛，時(shí)易牽引少腹、會(huì)陰部；陰囊體檢可觸及VC：④符合附睪炎或慢性前列腺炎、精囊炎診斷，精液檢查可見WBC、RBC，無精索靜脈曲張。⑤彩超明確分辨VC或附睪炎、前列腺炎、精囊炎。⑥排除其他原因?qū)е碌牟挥Y。凡同時(shí)符合上述①、②、③、⑤、⑥項(xiàng)者即診斷為VC不育癥，符合①、②、④、⑤、⑥項(xiàng)者為生殖系統(tǒng)炎癥性不育癥。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合VC不育癥或附睪炎不育癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡在25～45歲。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡＜25歲或＞45歲；②患有其他影響生殖功能疾病者；③1個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)服用其他治療不育癥的藥物和接受其他相關(guān)治療者。

1.3 精液標(biāo)本采集與儲(chǔ)存

禁欲2～7 d后取精，將通過手淫法采集的精液置無菌杯中，置37℃水浴箱中液化。將液化的精液通過離心機(jī)離心取精漿，置在3～5℃冰箱中保存。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 精液質(zhì)量檢測(cè) 采用WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng) （北京偉力科技發(fā)展有限公司），嚴(yán)格按照WHO《人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》（第5版）的方法檢測(cè)精液質(zhì)量。

1.4.2 精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶檢測(cè) 精漿中性α-糖苷酶、鋅、彈性硬蛋白酶、酸性磷酸酶、精子頂體酶定量檢測(cè)試劑盒采用廣東深圳華康生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司產(chǎn)品，嚴(yán)格按照說明書操作。正常值：精漿中性 α-糖苷酶≥20 mU/一次射精；鋅＞2.4 μmol/mL；彈性硬蛋白酶＜290 μg/L；酸性磷酸酶≥200 U/一次射精；精子頂體酶 48.2～218.7 μIU/一次射精。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精索靜脈曲張不育癥組與其他各組的精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的比較

A組與B組中性α-糖苷酶含量分別為（28.44±17.02）、（25.27±10.17）mU/一次射精，精子頂體酶含量分別為（70.20±49.02）、（50.93±38.64）μIU/106精子， 兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；鋅含量分別為（2.57±1.19）、（1.85±1.11）μmol/mL，彈性硬蛋白酶含量分別為（178.14±79.36）、（601.84±553.97）μg/L，酸性磷酸酶含量分別為（239.71±35.2）、（147.96±28.44）U/一次射精，兩組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；C 組中性 α-糖苷酶含量為（48.02±21.10）mU/一次射精，精子頂體酶含量為（138.46±99.14）μIU/106精子，與 A組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；鋅含量分別為（3.87±1.85）μmol/mL，與 A 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；彈性硬蛋白酶含量為（182.01±108.64）μg/L、酸性磷酸酶含量為（270.11±31.03）U/一次射精，與A組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D 組中性 α-糖苷酶含量為（50.82±20.85）mU/一次射精，鋅含量為（3.90±1.62）μmol/mL，精子頂體酶含量為（146.78±90.59）μIU/106精子，與 A 組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；酸性磷酸酶含量為（269.64±28.91）U/一次射精，與 A 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）； 彈性硬蛋白酶含量為 （177.77±86.55）μg/L，與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 見表1。

表1 精索靜脈曲張不育癥組與其他各組的精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的比較（±s）

表1 精索靜脈曲張不育癥組與其他各組的精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的比較（±s）

注：與 A 組比較，△P ＜0.05，＊P ＜ 0.01

組別 例數(shù) 中性α-糖苷酶（mU/一次射精） 鋅（μmol/mL） 彈性硬蛋白酶（μg/L） 酸性磷酸酶（U/一次射精） 頂體酶（μIU/106精子）A組13628.44±17.022.57±1.19178.14±79.36239.71±35.2170.20±49.02 B組3425.27±10.171.85±1.11＊601.84±553.97＊147.96±28.44＊50.93±38.64 C組3548.02±21.10＊3.87±1.85△182.01±108.64270.11±31.03138.46±99.14＊D組3550.82±20.85＊3.90±1.62＊177.77±86.55269.64±28.91△146.78±90.59＊

2.2 精索靜脈曲張不育癥各亞組精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的比較

精索靜脈曲張不育癥各亞組 A4組、A1組、A2組、A3組曲張程度逐漸加重，A1與 A2、A3與 A4等多組間比較，A1、A3組中性 α-糖苷酶含量分別為（31.87±20.45）、（21.57±7.15）mU/一次射精， 兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余精漿生化標(biāo)志物各指標(biāo)與精子頂體酶含量兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A2與 A1、A3與 A4等多組間比較，A2、A4 組頂體酶含量分別為 （53.11±19.34）、（74.73±42.41）μIU/106精子，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余精漿生化標(biāo)志物各指標(biāo)兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。A3 與 A1、A2、A4等多組間比較，A3、A4組中性 α-糖苷酶含量分別為 （21.57±7.15）、（34.12±19.34）mU/一次射精，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），頂體酶含量分別為（45.50±28.76）、（74.73±42.41）μIU/106精子，兩組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。A4與 A1、A2、A3組比較，A4與A1組精漿生化標(biāo)志物各指標(biāo)與精子頂體酶含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A4與 A2、A3組頂體酶含量、A3、A4組中性 α-糖苷酶含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余精漿生化標(biāo)志物各指標(biāo)與精子頂體酶含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表2。

表2 精索靜脈曲張不育癥各亞組精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的比較（±s）

表2 精索靜脈曲張不育癥各亞組精漿生化標(biāo)志物與精子頂體酶的比較（±s）

注：與 A3比較，△P＜0.05；與 A4比較，#P＜ 0.05，##P＜0.01

組別 例數(shù) 中性 α-糖苷酶（mU/一次射精） 鋅（μmol/mL） 彈性硬蛋白酶（μg/L） 酸性磷酸酶（U/一次射精） 頂體酶（μIU/106精子）A1組3431.87±20.45△2.70±1.23188.12±89.20243.02±29.6865.02±34.86 A2組3526.21±16.142.43±1.27186.79±87.44227.93±36.4153.11±19.34#A3組3521.57±7.152.32±1.01185.15±89.26218.99±36.8445.50±28.76##A4組3234.12±19.34△2.83±1.24187.85±88.84254.59±37.1174.73±42.41

3 討論

精索靜脈曲張?jiān)诓挥行灾邪l(fā)病率為25%～40%[1]，其導(dǎo)致男性不育的機(jī)制尚未完全闡明，臨床上普遍認(rèn)為與睪丸局部溫度過高、精索靜脈內(nèi)壓力增高、睪丸局部缺氧與pH值改變、腎上腺和腎靜脈內(nèi)的物質(zhì)反流、免疫因素等有關(guān)。近來有關(guān)VC導(dǎo)致不育的細(xì)胞分子機(jī)制取得了兩方面的重要進(jìn)展：細(xì)胞凋亡異常氧化應(yīng)激[3]。精漿含有維持精子生存的各種營養(yǎng)成分，又是精子運(yùn)動(dòng)的必需介質(zhì)。精漿中最有代表性的標(biāo)志物為中性α-糖苷酶、鋅、彈性硬蛋白酶、酸性磷酸酶等。實(shí)驗(yàn)可見VC不育癥患者與正常對(duì)照組相比，精漿的中性α-葡糖苷酶活性明顯下降，而且從表2可見，隨曲張程度加重，下降越明顯，從而影響精子的活動(dòng)力，首要原因是VC可引起睪丸、附睪內(nèi)的氧化應(yīng)激增多，附睪抗氧化機(jī)制異常[4]，導(dǎo)致活性氧（ROS）過度生成，一氧化氮升高，丙二醛的增加，進(jìn)而導(dǎo)致過多的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生而損傷生精細(xì)胞[5]；附睪上皮的凋亡增加影響附睪分泌功能。附睪的各個(gè)部分均有中性α-葡糖苷酶大量分泌，作為衡量附睪分泌功能的中性α-葡糖苷酶參與多糖分子內(nèi)的 α-1、4糖苷鍵，可催化多糖或糖蛋白中的碳水化合物分解為葡萄糖并為精子代謝和運(yùn)動(dòng)供能。精子成熟、獲能及受精過程伴有的比較活躍的糖基反應(yīng)都與中性α-葡糖苷酶活性有關(guān)，其活性降低可直接導(dǎo)致精液質(zhì)量下降[6]。VC患者精漿的中性α-葡糖苷酶活性下降的另一個(gè)原因，可能與精索靜脈曲張改變了附睪的血流動(dòng)力學(xué)、影響了附睪組織的正常代謝有關(guān)[7]。精漿鋅、酸性磷酸酶含量下降，常見于慢性前列腺炎患者，VC患者精漿中的鋅、酸性磷酸酶由前列腺分泌，酸性磷酸酶能參與精子代謝并有助于精子活力，其活性受雄激素調(diào)控。精漿鋅對(duì)男性生殖功能有非常重要的作用，能通過延緩脂質(zhì)過氧化而維持精子細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而保持精子活力，并可以清除由白細(xì)胞和有缺陷的精子產(chǎn)生的氧自由基，減少氧自由基對(duì)精子的毒性。本次實(shí)驗(yàn)可見VC可導(dǎo)致精漿鋅、酸性磷酸酶下降的機(jī)制還不清楚，可能與VC導(dǎo)致的精漿氧化應(yīng)激水平升高相關(guān)。不育癥患者彈性硬蛋白酶含量升高，常見于生殖系統(tǒng)感染，如附睪炎、前列腺炎等，生殖道感染時(shí)，分葉核粒細(xì)胞參與吞噬病原體等抗炎反應(yīng)，并分泌大量彈性硬蛋白酶至胞外，從而在精漿中表現(xiàn)。單純VC不育癥患者無感染，故本次實(shí)驗(yàn)VC組檢測(cè)值明顯低于附睪炎組。

精子的質(zhì)量除了從精子的運(yùn)動(dòng)能力衡量外，還需要有較高的受精能力，即能完成頂體反應(yīng)，穿過透明帶進(jìn)而和卵細(xì)胞融合，完成受精過程。VC患者的精子除了活動(dòng)力異常外，其受精能力也下降，主要表現(xiàn)為精子頂體酶含量下降，從表2可見，隨曲張程度逐漸加重，精子頂體酶含量下降越明顯。精子要穿透卵細(xì)胞的透明帶，必須完成頂體反應(yīng)以溶解透明帶，精子頂體酶則是參與頂體反應(yīng)的重要酶類物質(zhì)之一，在受精過程中起著非常重要的作用。頂體酶是與精子頂體膜相連的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，以酶原的形式儲(chǔ)存在頂體內(nèi)，在受精過程中起溶解透明帶，為精卵結(jié)合提供條件的作用，頂體酶活性是反映活精子質(zhì)量的重要指標(biāo)[8]。實(shí)驗(yàn)可見，VC患者精液頂體酶顯著低于正常對(duì)照組，可能是由于VC可導(dǎo)致精液中精子凋亡相關(guān)表型增加，包括精子質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl-serine，PS）外翻、線粒體功能障礙及精子核DNA損傷[9]。精子質(zhì)膜的完整性是精子具備正常受精能的重要因素，質(zhì)膜功能損害主要始于PS外翻，造成精子質(zhì)膜的成熟障礙，位于精子頂體內(nèi)層漿膜上的頂體酶活性隨之下降，精子的受精能力受影響。

本研究顯示，VC不育組中性α-糖苷酶活性、鋅、酸性磷酸酶、精子頂體酶含量均下降，彈性硬蛋白酶影響不明顯。隨曲張程度加重，中性α-糖苷酶活性、精子頂體酶含量下降越明顯，對(duì)精子的活動(dòng)力、受精能力的影響也進(jìn)一步加重，提示與VC不育癥患者的精漿氧化應(yīng)激的水平及生精細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。因而，臨床上對(duì)VC不育癥患者進(jìn)行中性α-糖苷酶活性、鋅、酸性磷酸酶、精子頂體酶進(jìn)行檢測(cè)，可充分了解VC對(duì)患者的損害程度，讓醫(yī)師采取正確的臨床決策，并可作為治療效果評(píng)價(jià)的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)。

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