異氟烷預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的線粒體機制探討

沈 潔，劉 洋

0 引言

肝缺血再灌注損傷(Hepatic ischemic reperfusion injury，HIRI)是肝臟外科疾病中常見的病理過程。在肝臟移植、肝臟良惡性腫瘤、外傷等進行的肝部分切除等需要阻斷入肝血流的手術(shù)中，不可避免造成肝缺血再灌注損傷，進而使肝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高，嚴重者可引起肝功能的損害甚至肝衰竭。對肝臟手術(shù)圍術(shù)期的肝保護方面的研究也越來越受到麻醉醫(yī)生和外科醫(yī)生的關(guān)注。因此，對HIRI的研究具有重要的理論意義和實用價值。

預(yù)處理(Preconditioning，PC)作為機體內(nèi)源性保護現(xiàn)象，在臨床上越來越受到人們的關(guān)注。預(yù)處理分為缺血、缺氧預(yù)處理和藥物預(yù)處理(應(yīng)用某種藥物而產(chǎn)生預(yù)處理作用)。由于缺血、缺氧預(yù)處理本身是傷害性應(yīng)激過程，對機體是一種創(chuàng)傷，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。藥物預(yù)處理具有相對安全、方便、劑量易于控制等優(yōu)點，成為近年來研究的熱點。線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(Mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channel，mitoKATP)在預(yù)處理中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，吸入麻醉藥預(yù)處理(Volatile anesthetic preconditioning，VAPC)的心肌保護作用與mitoKATP開放有關(guān)。線粒體是一個結(jié)構(gòu)和功能復雜而敏感的重要細胞器，在細胞凋亡過程中的多個關(guān)鍵性步驟都涉及線粒體。研究表明，缺血引起細胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載，線粒體通透性轉(zhuǎn)運通道(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)參與了神經(jīng)損傷，并且是缺血再灌注所致腦細胞損傷的關(guān)鍵部位。隨著藥物預(yù)處理研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)，線粒體是多類藥物作用的靶點，MPTP與mitoKATP通道在預(yù)處理中起著重要作用。

筆者前期對吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理在鼠腦缺血再灌注損傷中線粒體介導的保護作用研究中發(fā)現(xiàn)，此保護作用與抑制MPTP、降低線粒體Ca2+超載有關(guān)［1］。而肝組織含有大量MPTP，其是否參與吸入麻醉藥異氟烷對肝缺血再灌注損傷的保護作用尚不清楚。本研究通過對大鼠肝缺血再灌注損傷后MPTP及線粒體Ca2+濃度的檢測，旨在探討麻醉藥異氟烷預(yù)處理在肝部分缺血再灌注損傷中的作用及線粒體介導的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 健康雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量280～350 g，由我院動物部提供，每組15只。隨機分假手術(shù)組(S組)，缺血再灌注組(I/R組)，異氟烷預(yù)處理組(ISO組)，環(huán)胞菌素A(CsA，MPTP特異性阻滯藥)+ISO組和CsA組。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝缺血再灌注模型的制作 建立大鼠肝缺血再灌注模型，10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，采用腹腔弧形切口，充分顯露第一肝門，入腹后分離肝十二指腸韌帶，分離膽總管，應(yīng)用無創(chuàng)動脈夾阻斷肝左葉及后葉血流，造成70%肝臟缺血，但不阻斷肝右葉血流，以防門靜脈和胃腸道瘀血，60 min后松開動脈夾，再灌注120 min。整個實驗過程利用燈泡加熱，使直腸溫保持在36.7～37.3℃。

1.2.2 異氟烷預(yù)處理 將鼠置于100 cm×100 cm×100 cm的實驗艙里，使ISO濃度維持在1.2% ～1.5%，經(jīng)進氣孔吹入氧氣，氧濃度維持在不低于21%(Datex氣體監(jiān)測儀監(jiān)測)。

1.2.3 實驗操作 S組:入腹后只分離肝十二指腸韌帶，但不阻斷肝門血供;I/R組:肝臟缺血60 min，再灌注 120 min;ISO組:肝臟 I/R前60 min ISO(雅培公司)預(yù)處理30 min，之后在空氣中洗脫30 min。CsA+ISO組:CsA(sigma公司)50 mg/kg腹腔內(nèi)注射，30 min后同 ISO組。CsA組:I/R前30 min CsA 50 mg/kg腹腔內(nèi)注射。

1.2.4 取材及檢測 各組大鼠于再灌注2 h后迅速斷頭處死，摘取肝組織置于冰塊上，并用冰生理鹽水沖洗，部分肝組織于液氮中保存，分離線粒體進行線粒體游離鈣、MPTP含量檢測。

(1)線粒體懸浮液的制備:低溫差異法分離線粒體，用分離介質(zhì)制成懸浮液。取組織塊(0.5 g)在冰冷的生理鹽水中沖洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，放入小燒杯中;用移液管取預(yù)冷的分離介質(zhì)(0.01 mol/L 蔗糖、0.000 1 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L Tris-Hcl、0.8%NaCL，pH=7.4)，體積總量是組織塊重量的9倍，放入小燒杯內(nèi)，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，用組織搗碎機以約10 000 r/min研磨制成10%組織勻漿;取10%組織勻漿用低溫低速離心機以1 500 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液以10 000 r/min低溫高速離心機離心15 min，沉淀物為線粒體，線粒體用以上介質(zhì)制成懸浮液。取該懸浮液少許，用中性紅-詹納斯綠B染色后，在高倍顯微鏡下觀察，被染成亮綠色顆粒，即線粒體。整個過程均在0～4℃中進行。

(2)線粒體 Ca2+濃度的測定:根據(jù) Mccormack［2］的方法改進，以 Fura-2/AM 為 Ca2+熒光指示劑，用日本850型日立熒光分光光度計測定線粒體Ca2+濃度，發(fā)射波長510 nm，以430 nm激發(fā)光譜掃描。根據(jù)實測熒光值(F)、最大(Fmax)及最小(Fmin)熒光強度比值計算出Ca2+濃度，［Ca2+］i=Kd{(F-Fmin)/(Fmax-F)}，Kd為熒光指示劑的介電常數(shù)，F(xiàn)ura-2=224 nmol/L，單位為 nmol/(mg·L)。

(3)MPTP的測定:利用MPTP增大時線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導致吸光度明顯減少的原理，用1601型紫外分光光度計(島津公司，日本)，反應(yīng)條件為25℃、pH=7.4，線粒體蛋白濃度為0.5 mg/mL。反應(yīng)體系加入150 μmol/L的 Ca2+為激發(fā)劑，在540 nm波長處每分鐘記錄吸光度的變化，做吸光度的時間變化曲線，以達到平衡后的吸光度變化△S反映 MPTP開放的程度?！鱏越小，代表MPTP已經(jīng)開放的程度越大。

1.3 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，以±s表示，組內(nèi)和組間比較均采用單因素方差分析和配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體游離Ca2+濃度的變化 I/R組線粒體游離Ca2+濃度明顯高于S組和ISO組(P＜0.01);ISO組Ca2+濃度高于S組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而CsA+ISO組線粒體游離Ca2+濃度明顯高于ISO組(P＜0.01);CsA組與I/R組間差異無統(tǒng)計學意義。表明I/R后，肝臟組織線粒體Ca2+含量明顯增加，ISO預(yù)處理可以抑制其升高，而這種作用在預(yù)先用MPTP特異性阻滯藥CsA后被取消，見表1。

2.2 MPTP開放程度(ΔS)的變化 與 S組和ISO組相比，I/R組的ΔS明顯降低(P＜0.01)，I/R組與CsA組和CsA+ISO組ΔS之間差異無統(tǒng)計學意義;與ISO組相比，CsA+ISO組的ΔS值明顯降低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組肝臟線粒體Ca2+濃度和ΔS值的變化(±s)

表1 各組肝臟線粒體Ca2+濃度和ΔS值的變化(±s)

注:*與S組比較，P＜0.05;#與I/R組比較，P＜0.05;▲與ISO組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) Ca2+［nmol/(mg·L)］ΔS值S組15 119.07±9.22 2.47±0.29 I/R組 15 157.01±6.63* 1.42±0.11*ISO組 15 122.27±6.67# 2.10±0.25#CsA+ISO組 15 153.48±6.24＊▲ 1.50±0.28＊▲CsA組 15 144.70±10.60* 1.62±0.22*

3 討論

研究認為，導致細胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載，線粒體是細胞內(nèi)最大的鈣池之一，且成為細胞存亡的控制中心［3］。Ca2+又是MPTP開放的主要誘發(fā)因子，過量的Ca2+超過線粒體自身的承受限度時，則促使MPTP開放，使線粒體基質(zhì)代謝物喪失，膜電勢消失，ATP耗竭，線粒體腫脹，造成細胞損傷。MPTP是反映線粒體膜完整及其功能的重要指標，是一種由線粒體內(nèi)膜和外膜跨膜蛋白共同構(gòu)成的高電導非選擇性通道［4］，是一個至少由電壓依賴性陰離子通道(Voltage-dependentanion channel，VDAC)、腺嘌呤核苷酸移位酶(Adenine nucleotide translocase，ANT)、F1F0 ATP合酶(F1F0 ATP synthase)、親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D，CypD)、環(huán)孢菌素 A(Cycloporin A，CsA)受體組成的多蛋白復合體。正常情況下，MPTP復合體僅允許相對分子量小于1.5×103的化合物通過，因此，其有維持線粒體基質(zhì)和細胞胞質(zhì)之間滲透壓梯度的作用［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，MPTP是缺血再灌注所致肝臟細胞損傷的關(guān)鍵部位，伴隨著鈣超載而發(fā)生的氧化應(yīng)激，ATP的消耗及氧化磷酸化水平的提高，可以誘導線粒體內(nèi)膜上的 MPTP形成，從而改變線粒體的通透性。MPTP開放以后，由于氧化磷酸化的解耦聯(lián)及ATP的水解，導致線粒體功能障礙，最終導致細胞的凋亡或者死亡［5］。所以，減少線粒體Ca2+超載，抑制MPTP的開放，維持線粒體形態(tài)及功能正常，可能防止肝細胞死亡，起到肝保護作用。

肝臟 I/R損傷的發(fā)病機制十分復雜，其中Ca2+超載和MPTP開放是一個重要的原因［6-8］。在生理狀態(tài)下，Ca2+作為細胞內(nèi)第2信使，在維持細胞增殖、分裂、能量代謝、氧代謝方面發(fā)揮著重要作用。肝細胞Ca2+濃度約為0.2 μmol/L，細胞外液Ca2+濃度約為1.3 mmol/L，即肝細胞始終處于胞內(nèi)1萬倍濃度梯度的內(nèi)環(huán)境中。細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定的維持對于生命活動是至關(guān)重要的。本實驗中，I/R組大鼠肝臟線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，表明肝臟缺血60 min，再灌注120 min后，對肝臟產(chǎn)生了明顯的損傷;肝臟I/R時，細胞ATP減少，線粒體功能失常及細胞膜通透性增加，導致細胞內(nèi)鈣超載，從而激活磷脂酶C和磷脂酶A2，導致膜性結(jié)構(gòu)的破壞;激活鈣依賴蛋白酶，破壞細胞骨架與胞膜聯(lián)接的完整性而導致細胞損傷［9-10］;線粒體鈣超載對細胞產(chǎn)生的損傷是不可逆的。而I/R前給大鼠吸入麻醉藥ISO進行預(yù)處理后，線粒體游離Ca2+濃度明顯降低，防止了線粒體Ca2+超載，起到了一定程度的肝臟保護作用;另外，利用MPTP增大時線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導致吸光度明顯減少的原理，檢測了各組MPTP開放程度，發(fā)現(xiàn)大鼠I/R后，肝臟線粒體MPTP大量開放，這可能是線粒體自身調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)的不良后果，而Ca2+濃度增加又可誘發(fā)MPTP開放，產(chǎn)生正反饋的惡性循環(huán);而進行ISO預(yù)處理后，大鼠的MPTP開放受到明顯抑制，使線粒體游離Ca2+濃度降低，而Ca2+濃度降低又可抑制MPTP的開放，因此，減輕了I/R對大鼠肝臟的損傷，表明ISO預(yù)處理作用可能是通過抑制MPTP開放介導的。本研究設(shè)立了CsA組(藥物空白對照)，其線粒體游離Ca2+濃度和MPTP結(jié)果與I/R組比較，差異均無統(tǒng)計學意義，說明特異性MPTP通道阻滯劑CsA本身對大鼠肝臟損傷沒有作用;同時，對鼠進行ISO預(yù)處理前，采用特異性阻滯藥CsA腹腔注射干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，MPTP大量開放，逆轉(zhuǎn)了ISO預(yù)處理使線粒體游離Ca2+濃度降低及抑制MPTP開放作用，取消了ISO預(yù)處理的肝臟保護作用，進一步證明ISO預(yù)處理作用機制可能與抑制MPTP開放有關(guān)。

近年來，吸入麻醉藥預(yù)處理和后處理作用一直是麻醉學研究熱點之一，而其作用機制也不斷有新的發(fā)現(xiàn)［11-13］。有研究表明，異氟烷后處理作用也可能與抑制MPTP、減少線粒體Ca2+超載有關(guān)。還有研究認為，caspase-3的活化及 metallothioneins-Ⅰ/Ⅱ起到了重要作用［14-15］。該研究結(jié)果表明，異氟烷預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷具有一定程度的保護作用，這種作用可能與抑制MPTP開放、防止了線粒體Ca2+超載有關(guān)。筆者前期研究表明，ISO預(yù)處理對沙士鼠腦I/R損傷的保護作用可能是通過激活mitoKATP通道，使抗凋亡基因Bcl-2結(jié)合到線粒體膜上的量增加，同時阻止促凋亡基因Bax轉(zhuǎn)錄到線粒體膜上，從而抑制了MPTP的大量開放，發(fā)揮細胞保護作用。異氟烷預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用是否也通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，同時防止Bax轉(zhuǎn)錄到線粒體，通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位的的變化，影響MPTP，進而改變線粒體蛋白的釋放，阻斷凋亡途徑，發(fā)揮細胞保護作用，還有待于進一步研究探討。

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