秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫菌系的篩選及菌系功能強(qiáng)化研究

劉建一，辛剛

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319，2.佳木斯市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局）

在世界能源嚴(yán)重危機(jī)的今天，生物質(zhì)能成為僅次于石油、天然氣和煤的第四種重要能源，它是通過(guò)綠色植物的光合作用，將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為有機(jī)物中，囤積在生物體內(nèi)的一種能量。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年產(chǎn)生大量的秸稈等農(nóng)業(yè)廢物[1]，如何將這些生物質(zhì)能開發(fā)出來(lái)是目前我國(guó)科研領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)[2-3]。在以往的微生物秸稈發(fā)酵研究中，通常研究純菌對(duì)秸稈類物質(zhì)降解的效果，這種方法沒(méi)有考慮到自然條件下微生物的協(xié)同關(guān)系，試驗(yàn)從牛糞堆肥中篩選得到能夠降解秸稈產(chǎn)氫的菌系，并用生物方法對(duì)該菌系進(jìn)行功能強(qiáng)化，提高菌系的秸稈降解率和產(chǎn)氫率。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

纖維素產(chǎn)氫復(fù)合菌系樣品來(lái)自佳木斯周邊牛糞堆肥。

1.2 秸稈來(lái)源

水稻秸稈從建三江農(nóng)場(chǎng)采集，將取到的秸稈洗凈，然后高溫將其烘干，剪成長(zhǎng)度小于等于1 cm的秸稈段待用。

1.3 培養(yǎng)基配制

富集培養(yǎng)基：RFT培養(yǎng)基[4]。

秸稈培養(yǎng)基 （L-1）：NH4Cl 1.0 g，K2HPO41.5 g，K2HPO43.5 g，NaCl 1.0 g，MgCl20.5 g，KCl 0.2 g，酵母粉2.0 g，半胱氨酸0.5 g，秸稈5 g，蛋白胨2.0 g，維生素液[5]5 mL，微量元素溶液[5]1 mL，刃天青1.5mg，pH 7.0。

纖維二糖培養(yǎng)基：K2HPO43.5 g，NH4Cl 1.0 g，K2HPO41.5 g，MgCl20.5 g，半胱氨酸0.5 g，NaCl1.0 g，KCl 0.2 g，蛋白胨2.0 g，纖維二糖10 g，酵母粉2.0 g，維生素液[5]5 mL，微量元素溶液[5]1 mL，刃天青1.5mg，pH 8.5。

濾 紙 培 養(yǎng) 基 （L-1）：NH4Cl 1.0 g，1.5 g，MgCl2K2HPO43.5 g，K2HPO40.5g，NaCl 1.0 g，KCl 0.2 g，酵母粉2.0 g，半胱氨酸0.5 g，蛋白胨2.0 g，濾紙5 g，維生素液[5]5mL，微量元素溶液[5]1mL，刃天青1.5mg，pH 9.0。

如需配制固體培養(yǎng)基，即在原有的成分中另外添加20 g·L-1的瓊脂。

將各種培養(yǎng)基分裝于血清瓶?jī)?nèi)，在培養(yǎng)基配制的全過(guò)程中用高純氮?dú)馄?，連接金屬細(xì)針吹脫去除血清瓶中的氧氣，在121℃條件下，高壓滅菌20min。

1.4 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫菌系的富集與篩選

1.4.1 復(fù)合菌系的富集

分別稱取不同部位采集到的牛糞堆肥樣品10 g，裝入帶有數(shù)顆玻璃珠的無(wú)氧無(wú)菌水中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)1 h，利用玻璃珠之間碰撞產(chǎn)生的剪切力將樣品分散開，使樣品中的微生物均勻暴露于液體中。再將所得混合體系接種于富集培養(yǎng)基中，接種量為10%，37℃靜止富集10 d，將混合體系轉(zhuǎn)接到秸稈培養(yǎng)基中，接種量為10%，37℃靜止富集10 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次，分別測(cè)定是否有氫氣產(chǎn)生，有氫氣產(chǎn)生即為纖維素產(chǎn)氫菌系。

1.4.2 連續(xù)稀釋轉(zhuǎn)接獲得高效產(chǎn)氫菌系

選取降解秸稈產(chǎn)氫效果較好的菌系，用無(wú)菌水將所得菌系進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋度為10-3～10-9的菌液分別接種到秸稈培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取樣利用氣相色譜測(cè)定（4890，Agilent）產(chǎn)氫效果，當(dāng)測(cè)得產(chǎn)氫量升高，及時(shí)將菌系再次稀釋10-2～10-9倍，不斷重復(fù)此過(guò)程以得到高產(chǎn)氫復(fù)合菌系。

1.5 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫純菌的分離與篩選

以纖維二糖為底物制作固體培養(yǎng)基，分別取5mL培養(yǎng)基注入?yún)捬豕苤?，全程用高純氮?dú)獯得?，高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降至50～60℃時(shí)，分別取菌液0.5、1.0、1.5、2.0mL，注入?yún)捬豕苤校繚舛仍O(shè)置3組重復(fù)。采用改良的Hungate[6-7]厭氧滾管技術(shù)，將菌種均勻分布在厭氧管中，放于恒溫箱中，37℃倒置培養(yǎng)20 d，待菌落長(zhǎng)出后，分別挑取單一菌落接種到厭氧濾紙液體培養(yǎng)基中，120 r·min-1培養(yǎng)，觀察濾紙的崩解情況，定期在顯微鏡下觀察菌種狀態(tài)，反復(fù)分離3～5次，待觀察到菌體形態(tài)一致即認(rèn)為是純菌。

1.6 秸稈降解率測(cè)定方法

將發(fā)酵后的液體離心，收集剩余秸稈用蒸餾水沖洗，反復(fù)沖洗離心后，放于恒溫箱中，烘干待質(zhì)量不變化后測(cè)重。

秸稈降解率=（原始秸稈質(zhì)量-殘留秸稈質(zhì)量）/原始秸稈質(zhì)量×100%。

1.7 原子力顯微鏡觀察

將培養(yǎng)得到的新鮮菌體培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋后，吸取10～15μL的懸浮液置于無(wú)菌載玻片上，將菌體固定10 min后，利用原子力顯微鏡（DI BioScope，Veeco）成像觀察。

1.8 產(chǎn)氫菌系的生物學(xué)特性

將分離的純菌在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9 菌系生物強(qiáng)化效果研究

準(zhǔn)備若干瓶新鮮的培養(yǎng)基，分別向培養(yǎng)基中接種比例為10%的菌系CYY，將這些菌系分別培養(yǎng)到5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 h待用，培養(yǎng)菌株CYY-9，待其處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)使用。將處于對(duì)數(shù)時(shí)期的菌株CYY-9分別接種到已經(jīng)培養(yǎng)的菌系CYY培養(yǎng)基中，接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%?；旌吓囵B(yǎng)24 h后，按時(shí)測(cè)定不同組合的總產(chǎn)氫量（mL·L-1culture），每組做三個(gè)重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫菌系的富集篩選

富集得到能在秸稈培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并具有較好的產(chǎn)氫效果的菌系。將該菌系梯度稀釋后接種于新鮮培養(yǎng)基中，每24 h測(cè)定氫含量，當(dāng)氫含量上升時(shí)，說(shuō)明此時(shí)菌系中利用秸稈產(chǎn)氫的微生物活性強(qiáng)，反復(fù)將其稀釋轉(zhuǎn)接，從而得到產(chǎn)氫含量較高的菌系CYY。

2.2 產(chǎn)氫菌系的生物學(xué)特性

2.2.1 菌體的形態(tài)及生長(zhǎng)曲線

圖1為顯微鏡（油鏡）下菌系形態(tài)圖，圖中有長(zhǎng)短不一的桿狀菌，吸附在秸稈周圍。由菌體的生長(zhǎng)曲線可見，菌株CYY在培養(yǎng)16到60 h時(shí)處于對(duì)數(shù)期，當(dāng)培養(yǎng)到55 h，菌體的生長(zhǎng)趨于平緩，說(shuō)明達(dá)到穩(wěn)定期，故應(yīng)該選擇培養(yǎng)40 h到55 h的菌體進(jìn)行接種。60 h以后菌體的生長(zhǎng)開始下降，此時(shí)菌體間爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)可能某些菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)菌系的生長(zhǎng)起到抑制作用。

圖1 菌系CYY吸附秸稈效果圖Fig.1 Strains of CYY adsorption straw renderings

圖2 菌圖體3 菌生體長(zhǎng)生量長(zhǎng)量隨隨培時(shí)養(yǎng)間變時(shí)化間曲變線化曲線Fig.2 The cave of strain growth with time

圖3 不圖同4 溫不同度溫下度菌下菌體體的的生生長(zhǎng)長(zhǎng)情情況況Fig.2 The state of strains in different temputure

圖4 不同pH條件下菌體生長(zhǎng)情況Fig.4 The state of strains growth in different pH

2.2.2 菌系生長(zhǎng)的最適溫度

將菌株CYY在溫度分別為25、30、35、40、45、50、55、60℃的條件下恒溫培養(yǎng)后，分別測(cè)定OD值，得到圖3所示的結(jié)果，該菌能在25～60℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，當(dāng)環(huán)境溫度較低時(shí)，不適于菌體的繁殖，當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量最大。當(dāng)溫度高于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，由于高溫使菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)逐漸失活，導(dǎo)致菌體的狀態(tài)量下降。

2.2.3 菌株生長(zhǎng)的最適pH值

將菌株分別轉(zhuǎn)接到pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌的生長(zhǎng)量，得到結(jié)果如圖4，該菌體在酸性條件下可以生長(zhǎng)，但是生長(zhǎng)量很低，當(dāng)pH為8.5時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量達(dá)到最大值1.37，同時(shí)當(dāng)pH在9左右也有較高的生物量，該菌的性質(zhì)滿足作洗滌劑的條件，該研究為該菌系在洗滌劑方面的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

2.3 菌系的產(chǎn)氫效果

在37℃，pH為8.5的條件下，對(duì)菌體連續(xù)傳代17次，菌系產(chǎn)氫趨于穩(wěn)定，氫氣產(chǎn)量為90 mL·L-1culture，氫氣含量為13.4%，秸稈降解率為39.3%。

2.4 秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫純菌的篩選結(jié)果

將菌系CYY培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，立即進(jìn)行10-1梯度稀釋，采用改良的Hungate厭氧滾管技術(shù)，反復(fù)對(duì)菌體進(jìn)行分純，經(jīng)多次純化后，觀察到厭氧管上菌落形態(tài)一致，認(rèn)定為純菌。將得到的單菌落分別接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，分離得到5株細(xì)菌，分別用CYY-9、CYY-11、CYY-12、CYY-14、CYY-15命名。

將所得菌株接種于秸稈培養(yǎng)基，進(jìn)行靜態(tài)產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，幾株菌均可以對(duì)分解濾紙，其中CYY-9和CYY-11兩株菌崩解濾紙效果最好。比較各菌產(chǎn)氫效果，結(jié)果見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，菌株CYY-9有較好的產(chǎn)氫效果，選擇CYY-9作為后續(xù)研究對(duì)象。

表1 各菌株產(chǎn)氫效果比較Table1 The effetof producetion hydrogen by strain separated

2.5 菌株CYY-9形態(tài)及生長(zhǎng)特性

利用原子力顯微鏡觀察，如圖5，菌株CYY-9為桿狀菌，周邊無(wú)鞭毛，菌體表面光滑。此菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH值為8.5。菌株CYY-9在固體培養(yǎng)基中菌落表面光滑均勻，呈白色，不透明。

圖5 菌株CYY-9形態(tài)圖Fig.5 The characterization of strain JYB-13 under AFM

2.6 菌系生物強(qiáng)化效果

將菌株CYY-9接種到菌系中的最初一段時(shí)間內(nèi)，各試驗(yàn)組中樣品的產(chǎn)氫能力均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，有些組甚至出現(xiàn)不產(chǎn)氫的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能是由于菌系內(nèi)部各菌株長(zhǎng)期適應(yīng)性的結(jié)果，個(gè)菌體在菌系中比例穩(wěn)定，數(shù)量和功能相互協(xié)調(diào)，當(dāng)有外來(lái)菌株侵入時(shí)，導(dǎo)致菌系內(nèi)部的組成結(jié)構(gòu)變化，菌系內(nèi)各菌需適應(yīng)新的環(huán)境，所以導(dǎo)致產(chǎn)氫能力呈暫時(shí)下降趨勢(shì)。由表2可知，當(dāng)菌系培養(yǎng)到40 h左右，接種菌株CYY-9，接種量為4%時(shí)，復(fù)合菌系的產(chǎn)氫能力最強(qiáng)，產(chǎn)氫量達(dá)到103 mL·L-1culture，在菌系培養(yǎng)初期添加菌株CYY-9時(shí)，此時(shí)接種量較低，兩部分菌株暫時(shí)可以同時(shí)生長(zhǎng)，產(chǎn)氫結(jié)果與未添加CYY-9時(shí)的菌系相差不多。隨著樣品的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)菌系生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)，菌系內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能越來(lái)越穩(wěn)定，適應(yīng)能力增強(qiáng)，此時(shí)接種較少的菌株CYY-9，復(fù)合菌系中的各菌共同生長(zhǎng)，菌系中各種產(chǎn)氫菌能力均能得到極大地發(fā)揮。當(dāng)菌系生長(zhǎng)到穩(wěn)定期以后再接種菌株CYY-9，效果較差，此時(shí)菌系生長(zhǎng)能力穩(wěn)定，甚至逐漸出現(xiàn)衰退，菌種產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物可能對(duì)新填入的品種產(chǎn)生毒害作用，各部分的產(chǎn)氫能力很難發(fā)揮出來(lái)。

表2 不同復(fù)配條件菌系產(chǎn)氫量/m L·L-1 cultureTable2 The componentof straw under defferent disposing/mL·L-1 culture

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從牛糞堆肥中篩選出一個(gè)能降解秸稈，有較好產(chǎn)氫效果的菌系CYY，菌系生長(zhǎng)的最適溫度是37℃，最適生長(zhǎng)pH為8.5，在秸稈培養(yǎng)基中，氫氣產(chǎn)量為90mL·L-1culture，氫氣含量達(dá)到13.4%，稈降解率為39.3%。

利用改良的Hungate厭氧滾管法，在菌系CYY中篩選得到一株能夠較好的降解秸稈產(chǎn)氫的菌株CYY-9，此菌形態(tài)為桿狀，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH值為8.5。

將菌系CYY培養(yǎng)到40 h左右，將菌株CYY-9以一定比例接種到菌系中，測(cè)定得到當(dāng)菌株CYY-9接種量為4%時(shí)，復(fù)合菌系的產(chǎn)氫能力最強(qiáng)，產(chǎn)氫量達(dá)到103mL·L-1culture，增長(zhǎng)率為12.9%，秸稈降解率達(dá)49.2%，增長(zhǎng)率為25.5%，達(dá)到對(duì)菌系CYY產(chǎn)氫能力強(qiáng)化的目的。

[1]陳洪章.纖維素生物技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2]李鵬，孫可偉，柴希娟.秸稈的綜合利用[J].中國(guó)資源綜合利用，2006，24（1）：23-27．

[3]李永峰，徐菁利，張文啟，等.生物制氫細(xì)菌分離培養(yǎng)與分子鑒定技術(shù)進(jìn)展[J].上海工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，20（2）：124-128.

[4]丁繼峰，張東杰.玉米胚芽蛋白酶解工藝條件優(yōu)化研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（5）：68-72.

[5]Kumar S，Tamura K，NeiM.MEGA3：Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence Alignment[J].Brief Bioinform，2004（5）：150-163.

[6]周瑤，王穎，安宇，等.奶酪中產(chǎn)桿菌樣細(xì)菌素乳酸菌的分離與鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（3）：60-63.

[7]Levin D B，Islam R N，Cicek R.Sparling.Hydrogen Production by Clostridium thermocellum 27405 from Cellulosic Biomass Substrates[J].Hydrogen Energy，2006，31：1496-1503.