UA-SPE-HPLC快速分離法測定乳飲料中的硫氰酸鈉的研究

張麗媛，姚笛，賈鵬宇，王穎，李秀波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究中心）

牛乳及其制品以其營養(yǎng)價值高，富含鈣、維生素D等營養(yǎng)成分而受到大眾的歡迎，但也因此成為摻假、制假的溫床。據(jù)報道，健康牛奶中平均含有0.9 mg·kg-1的硫氰酸離子，是乳制品過氧化物酶抗菌體系的主要成分之一。含乳飲料是以鮮乳或乳制品為原料，經(jīng)發(fā)酵或未經(jīng)發(fā)酵加工制成的制品，含乳飲料中摻入硫氰酸鈉后可有效的抑菌、保鮮，但硫氰酸鈉能在體內(nèi)釋放氰根離子，并很快與細胞色素氧化酶中的三價鐵離子結(jié)合，抑制該酶的活性，使組織不能利用氧而導(dǎo)致人昏迷[1]。另有報道稱，由于硫氰酸鈉在人體內(nèi)代謝可形成硫氰酸，可干擾人的甲狀腺功能，導(dǎo)致非缺碘性甲狀腺腫，影響人體正常生理代謝[2]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于硫氰酸鹽的研究多集中在化學(xué)和生物方面，如運用硫氰酸鹽離子吸附形成復(fù)雜的離子交換劑[3]、硫氰酸鈉對銀腐蝕溶出度氨基硫脲解率的影響[4]等。在硫氰酸鈉檢測方法方面主要有毛細管電泳法[5]、離子色譜法[6]、分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、電化學(xué)法[9]。張永峰[10-11]等建立了離子色譜/電導(dǎo)檢測分析奶粉、牛奶中硫氰酸鹽的方法，針對不同形態(tài)的乳制品前處理方法進行重點研究和討論。宋潔[12]等利用頂空進樣-氣相色譜法檢測乳制品中硫氰酸鹽的含量，采用蒸餾水提取乳制品中的硫氰酸鹽，用乙酸鋅沉淀乳制品中的蛋白質(zhì)，將硫氰酸離子衍生后，采用頂空進樣，氣相色譜法檢測。

主要研究了乳飲料中硫氰酸鈉的前處理方法，利用乙腈加酸溶液沉淀蛋白，超聲輔助萃取乳飲料中的硫氰酸鈉，固相萃取柱進行凈化，高效液相色譜法[13]進行檢測，并對超聲時間、萃取條件等進行討論和研究。

1 材料和方法

1.1 試劑

三氯乙酸、硫氰酸鈉、丙酮、乙醚、乙酸乙酯，以上均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

硫氰酸鹽標準儲備液：稱取在80℃下烘2 h的硫氰酸鈉0.083 17 g于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，即得濃度為500μg·mL-1的硫氰酸鹽標準儲備液。

硫氰酸鈉標準溶液：將硫酸氰鈉標準儲備液（500μg·mL-1） 逐級稀釋得到濃度為0.020、0.10、0.50、2.50、12.50、20.00 mg·mL-1的標準溶液。

0.02 moL·L-1磷酸鹽緩沖溶液：稱取含兩個結(jié)晶水的磷酸二氫鈉0.312 g，加水溶解并定容至100mL，加磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0，經(jīng)0.22μm微孔濾膜（水相）過濾后備用。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（PC-2025型，美國SSI有限公司），配紫外檢測器；超聲波儀（上海生析超聲波儀器有限公司）；分析天平（Mettler AE240，瑞士）；高速離心機（安徽中科中佳儀器有限公司）；一次性水系（纖維素）、有機系（尼龍）針式濾膜（0.22μm，天津市蘭博儀器公司）。

1.3 加標樣品

乳飲料：乳飲料樣品共5種，復(fù)原乳樣品、爽歪歪，AD鈣奶和味動力及優(yōu)酸乳分別設(shè)為樣品1、2、3、4、5，均購買自超市。在2.2.2中的樣品分別是樣品1、2、3、4、5，其他所有結(jié)果都是由樣品1獲得。在乳飲料樣品中加入硫氰酸鈉標準溶液并振搖2 min獲得加標樣品溶液。

1.4 萃取過程

準確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入5.0μg·mL-1標準溶液20μL，振搖混均后向其加入少量去離子水、2mL 0.1moL·L-1三氯乙酸和30 mL乙腈，最后用去離子水定容，超聲提取10 min，14 000 r·min-1離心5 min，靜置，取上清液濾入10 mL離心管中，氮氣吹干，用去離子水定容。過經(jīng)2mL甲醇、2 mL水活化后的C18固相萃取小柱，收集流出液，過0.22μm有機濾膜待測。在50mL離心管中，不加入乳飲料，其他按照上述過程依次處理，過膜后得到空白樣品溶液待測。

1.5 硫氰酸鈉的HPLC測定

色譜條件：色譜柱：XDB C18柱（5 mm，4.6 mm×150 mm）；C18（4.0 mm×50 mm） 保護柱。流動相：0.02 moL·L磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（50∶50）；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：218 nm；定量環(huán)體積：20μL。

將空白樣品溶液、標準溶液、加標樣品溶液和樣品溶液依次按照上述色譜條件進行HPLC分析，得到色譜圖以及峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的確定

樣品前處理的基本原則是：首先用去離子水對目標物進行提取，再采用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)，進而用固相萃取小柱凈化、去除脂肪等有機物，得到測試液。鑒于硫氰酸鈉無機鹽的屬性以及定量計算方便，選擇三氯乙酸加有機溶劑沉淀蛋白—超聲提取—固相萃取柱凈化的前處理方法，可以有效去除蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)的影響，有利于提高提取效率和凈化效果，得到較滿意的結(jié)果。

2.1.1 蛋白沉淀劑的選擇

蛋白沉淀劑的選擇直接影響著后續(xù)HPLC法的分析性能?？疾觳煌袡C溶劑甲醇、丙酮、乙腈以及酸溶液、堿溶液對乳飲料樣品的蛋白沉淀效果，實驗結(jié)果如圖1。單一選擇有機溶劑進行蛋白沉淀時易出現(xiàn)分層現(xiàn)象，結(jié)合圖1結(jié)果中回收率情況，加入2 mL 0.1 moL L-1三氯乙酸和30 mL乙腈進行蛋白沉淀，可以更有效的去除乳飲料中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

2.1.2 超聲時間

在超聲功率150W、溫度25℃條件下，考察超聲時間范圍變化從5、7、10、13、15 min對回收率的影響。結(jié)果如圖1，隨著超聲時間增加，樣品中硫氰酸鈉提取回收率隨之增加，超聲時間增加到一定時間后提取回收率無明顯影響。因此選擇10 min為最優(yōu)超聲時間。

圖1 蛋白沉淀劑的影響Fig.1 Effectof protein precipitation agent

圖2 超聲時間的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time

圖3 SPE類型的影響Fig.2 Effectof type of SPE cartridges

圖4 柱溫的影響Fig.4 Effectof column temperature

2.1.3 固相萃取柱類型

選擇固相萃取柱的主要目的是凈化，因為主要干擾硫氰酸鈉檢測的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)，脂肪、氨基酸和水溶性維生素。研究進一步考察HLB、MCX、Si、C18、C8（規(guī)格均為300mg，6mL）5種不同填料的SPE柱，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明C18柱對樣品凈化效果最好。

2.1.4 柱溫的影響

色譜柱的柱溫對硫氰酸鈉的分離分析有一定的影響，升高柱溫可以保留時間提前，分離效果變好，但是升高到一定程度后保留時間變化不明顯，還會影響分離效果。見圖4，最終選擇35℃為最佳柱溫。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關(guān)系

以硫氰酸鈉標準溶液濃度和所得色譜峰面積繪制標準曲線，得到線性回歸方程；同時得到硫氰酸鈉的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD和LOQ均由以下公式得到：

σ是11個空白樣品直接引入到HPLC分析得到的信號的標準偏差，k是曲線的斜率。所得數(shù)據(jù)如表1。

表1 工作曲線和線性范圍Table1 Working curves and Linear range

2.2.2 樣品分析

通過評價方法的精密度和回收率分析5種乳飲料樣品，（1）標準溶液、（2）空白樣品1溶液、（3）加標樣品1溶液、（4）牛奶樣品2如圖5所示。7種牛奶樣品都檢出硫氰酸鈉，檢出量數(shù)據(jù)如表2。

圖5 標準溶液（1），空白溶液（2），加標樣品溶液（3），樣品溶液（4）的色譜圖Fig.5 Chromatograms of standard solution（1），blank solution（2），spiked sample solution（3），sample solution（4）

表2 硫氰酸鈉檢出量Table2 Detectable amountof Sodium Thiocyanate

對于同一個樣品分別加入兩個不同濃度水平的標準溶液（2.00、20.00μg·kg-1），每一個樣品一天內(nèi)分析三次，求得日內(nèi)精密度；三天內(nèi)每天分析一次，求得日間精密度，都是由相對標準偏差（RSD）表示。

表3 牛奶樣品的分析結(jié)果Table3 Analytical results of dairy samples

3 結(jié)論

建立了超聲輔助萃取/固相萃取柱凈化/高效液相色譜快速測定乳飲料中硫氰酸鈉的方法，針對樣品前處理技術(shù)進行研究，并對萃取、凈化條件進行優(yōu)化。3min完成硫氰酸鈉的檢測，并在0.05～50mg·kg-1范圍內(nèi)具有良好的線性，檢測限為0.024mg·kg-1。經(jīng)此方法檢測5種乳飲料樣品，（下均檢出不同程度的硫氰酸鈉殘留，最高達到95.40mg·kg-1。經(jīng)檢測樣品2—爽歪歪、3—AD鈣奶、5—優(yōu)酸乳疑似添加，飲用不安全。此方法前處理簡單、分析快速，為乳飲料中硫氰酸鈉的質(zhì)量監(jiān)控提供了可靠的檢測手段。

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