哮喘小鼠肺組織中IL－17及IL－17受體的變化

劉曉丹 張 晗 尚云曉

1 遼寧省沈陽市兒童醫(yī)院內(nèi)科 110032； 2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科

近年來兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制和治療方法越來越被人們所關(guān)注。支氣管哮喘是多種炎性細(xì)胞和炎癥因子相互作用而形成的慢性呼吸道炎癥性疾病。哮喘的核心是氣道高反應(yīng)性，其本質(zhì)是呼吸道慢性炎癥，以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等通過釋放炎癥因子和細(xì)胞因子而起主要作用。但目前哮喘確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，許多臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，IL－17與哮喘關(guān)系密切。白細(xì)胞介素－17（interleukin17，IL－17）是由一種新型的不同于Th1型和Th2型的CD4＋效應(yīng)T 細(xì)胞－Th17 細(xì)胞亞群特異性產(chǎn)生［1，2］，IL－17是一個N末端信號肽含有155個氨基酸的糖蛋白，由二硫鍵連接的同源二聚體組成，在C末端區(qū)域有5個空間上保守的半胱氨酸殘基，形成IL－17家族典型的半胱氨酸結(jié)節(jié)。在人類和小鼠中至少存在6個IL－17家族成員的配體（IL－17A～F）和5個受體（IL－17RA～D 和SEF）［3］。IL－17可以通過促進(jìn)釋放前炎癥細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng)，具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的作用，可促進(jìn)IL－6、IL－8、粒細(xì)胞集落刺激因子以及前列腺素E2等細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)大量黏液分泌，增加氣道高反應(yīng)性，與哮喘等氣道炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)采用哮喘模型為研究對象，動態(tài)觀察不同時間IL－17及IL－17受體的動態(tài)表達(dá)。旨在探討哮喘小鼠肺組織中IL－17及IL－17受體的變化趨勢，為進(jìn)一步深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 BALB／c小鼠64只，周齡4周，體重16～20g，中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動物部提供；小鼠IL－17及IL－17受體ELISA試劑盒購自美國R＆D公司；卵蛋白購自美國Sigma公司；氫氧化鋁粉劑購自沈陽化工三廠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制作。選用4周齡的BALB／c小鼠64只，雌雄各半，分為哮喘組32只、正常對照組32只，置于SPF級清潔動物室，在標(biāo)準(zhǔn)條件下分籠飼養(yǎng)。哮喘組第1天小鼠腹腔注射20μg卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）和2mg氫氧化鋁（混于0.5ml磷酸鹽緩沖液中）致敏，再分別于第8、15、22天予每只小鼠腹腔注射10μg OVA和1mg氫氧化鋁（混于0.5ml磷酸鹽緩沖液中），于第23～29天每日應(yīng)用4%OVA霧化吸入1次，25～30min／次至喘息發(fā)作，小鼠表現(xiàn)為煩躁不安、頭面部瘙癢、抓耳撓腮、呼吸急促、弓背等。

1.2.2 肺組織勻漿及肺泡灌洗液的采集。兩組小鼠于造模后第3、7、14、21天4個時間點(diǎn)進(jìn)行取材，每個時間點(diǎn)取8只。首先注射10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后將小鼠仰臥位固定，常規(guī)碘酒、酒精消毒頸部及胸部，以無菌專用器械（0.1%的DEPC浸泡24h，高壓滅菌）操作。打開胸腔，分離頸部氣管，結(jié)扎右主支氣管，注入0.5ml PBS溶液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次。收集肺泡灌洗液（回收 率 ＞80% 為 合 格），4℃ 離 心 （3 000r／min，15min），取上清－80℃冰箱保存。取左肺組織，切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS，用液氮迅速冷凍。其后標(biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度，加入一定量的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20min（2 000～3 000r／min），收集上清，于EP管中－80℃冰凍保存。

1.2.3 IL－17及IL－17受體含量的 ELISA 檢測。將肺泡灌洗液及肺組織勻漿按酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后使用BIORAD酶標(biāo)儀測量450nm處波長吸光度（OD值）檢測IL－17及IL－17R的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或三組以上比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組與正常組小鼠肺泡灌洗液中IL－17含量比較 哮喘組較正常組各時間點(diǎn)肺泡灌洗液（BALF）IL－17含量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。哮喘組BALF中IL－17含量在第7天達(dá)到高峰，其后IL－17含量逐漸下降（見表1）。

表1 肺泡灌洗液中IL－17的含量（±s，n＝8，pg／ml）

表1 肺泡灌洗液中IL－17的含量（±s，n＝8，pg／ml）

注：與正常組比較＊P＜0.05。

分組 3d 7d 14d 21d哮喘組 66.54±5.07＊ 86.14±3.51＊ 76.65±2.60＊ 66.07±3.97＊正常組 45.76±2.65 44.59±2.77 42.68±3.4844.23±2.69

2.2 哮喘組與正常組小鼠肺組織勻漿中IL－17受體含量比較 哮喘組較正常組各時間點(diǎn)肺組織勻漿中IL－17R含量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL－17R含量在第7天達(dá)到高峰，其后IL－17R含量逐漸下降（見表2）。

表2 肺組織勻漿中IL－17R的含量（±s，n＝8，pg／ml）

表2 肺組織勻漿中IL－17R的含量（±s，n＝8，pg／ml）

注：與正常組比較＊P＜0.05。

分組 3d 7d 14d 21d哮喘組 53.49±3.19＊ 64.77±4.37＊ 58.21±2.61＊ 54.06±3.63＊正常組 35.14±5.47 38.02±3.10 35.19±4.5737.61±4.15

3 討論

支氣管哮喘是由各種抗原和化學(xué)刺激物所引起的慢性氣道炎癥，是炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子相互作用參與的過程，其發(fā)病率逐年增高，但目前哮喘確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。最近研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的肺組織，支氣管肺泡灌洗液及痰液中IL－17顯著升高，而且與氣道高反應(yīng)性的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［4～6］。馬超等研究也顯示，IL－17表達(dá)水平隨哮喘病情加重而升高，IL－17可促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化、趨化及募集，參與哮喘的發(fā)生［7］。IL－17與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化密切相關(guān)［8］，還能通過IL－8等途徑對中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化和活化作用［9］。國外有研究顯示，哮喘小鼠氣道黏膜有Th17浸潤［10］，Th17主要的效應(yīng)因子IL－17對炎性細(xì)胞有強(qiáng)大的化學(xué)趨化作用，可以顯著增加中性粒細(xì)胞在呼吸道內(nèi)局部浸潤，并通過中性粒細(xì)胞在哮喘的炎癥形成及氣道重塑中發(fā)揮作用。在哮喘中IL－17可通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌IL－6、IL－8及前列腺素E2等，與成纖維細(xì)胞一起促進(jìn)CD34＋細(xì)胞增殖、分化為成熟中性粒細(xì)胞［11］。研究表明，IL－17受體缺陷小鼠肺內(nèi)的中性粒細(xì)胞減少，而IL－17過度表達(dá)可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性蛋白－2和G－CSF的產(chǎn)生介導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集［12］，刺激相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生［13，14］。IL－17誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、支氣管成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等釋放IL－6、GM－CSF、腫瘤壞死因子（TNF－丫）、單核細(xì)胞趨化蛋白－1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集及造成炎癥損傷［15］。IL－17也可促進(jìn)杯狀細(xì)胞增生，增加黏蛋白表達(dá)，形成黏液栓參與哮喘的發(fā)生［16］。

本研究建立了哮喘小鼠模型，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測小鼠肺組織中IL－17及IL－17受體的含量，結(jié)果顯示哮喘組各時間點(diǎn)IL－17及IL－17受體含量較正常組明顯升高，且在造模后第7天哮喘組中IL－17及IL－17受體含量達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL－17及IL－17受體含量隨著造模時間的延長呈先增高后降低的趨勢，可能是參與支氣管哮喘急性發(fā)作的主要細(xì)胞因子之一，但具體相關(guān)作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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