脂質(zhì)體作為疫苗佐劑的研究進展

王禮燕 郭亞東 魯衛(wèi)東

昆明醫(yī)科大學藥學院，云南 昆明 650500

1 免疫佐劑

1.1 免疫佐劑的概述 在免疫學中，佐劑 (adjuvant)是指能夠增強或調(diào)節(jié)抗原體液或細胞免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑在有限抗原數(shù)量時有助于誘導(dǎo)早期的、較強的和長時間的免疫應(yīng)答。成為純化疫苗，亞單位疫苗和DNA疫苗研究的焦點，這些疫苗的免疫原性較弱，需要佐劑來激活免疫應(yīng)答[1-4]。隨著免疫學研究的不斷深入和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，基于對免疫效果和生產(chǎn)使用成本降低的追求，佐劑的研究在現(xiàn)代免疫學中顯得越來越重要。通過提高佐劑的效果，達到減少抗原用量，降低對機體的毒副作用，是理想佐劑的一個重要標志。

1.2 疫苗佐劑的研究現(xiàn)狀 2009年以前，鋁佐劑是美國FDA唯一認可用于人用疫苗的佐劑。但由于鋁佐劑疫苗引發(fā)不夠理想的Th1免疫應(yīng)答以及較弱的細胞免疫，并且，以鋁化合物為佐劑的疫苗無法冷凍保存，限制了鋁佐劑在疫苗使用中的廣泛性，因而尋找替代佐劑迫在眉睫[5]。在所有替代佐劑的研究中，脂質(zhì)體是最具發(fā)展前景的一種。1974年，Gregoriadis和Allison首次報道了脂質(zhì)體作為免疫佐劑的應(yīng)用[6-7]。從此，脂質(zhì)體以及相關(guān)的泡囊載體作為高效的誘導(dǎo)體液及細胞免疫的佐劑廣泛用于感染性疾病及癌癥疫苗中[8-10]。目前，至少有8種脂質(zhì)體佐劑疫苗系統(tǒng)被批準用于人用或在進行臨床實驗[5]。其中，瑞士Crucell的流感疫苗Inflexal V及甲型肝炎疫苗Epaxal是目前上市的唯一兩種脂質(zhì)體佐劑疫苗。

2 脂質(zhì)體

2.1 脂質(zhì)體的形態(tài) 脂質(zhì)體 (liposome)自1960年由英國學者Bangham首次制得，系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層形成的薄膜中間所制成的超微型球狀藥物載體制劑。是由脂質(zhì)雙分子層組成的、內(nèi)部為水相的閉合囊泡，具有生物膜的功能和特性，如圖1，圖2。

脂質(zhì)體主要是由磷脂及其它附加劑組成，磷脂在脂質(zhì)體中形成雙分子層，其它附加劑起到提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和靶向性等作用。由于脂質(zhì)體包封材料的特殊性，具有很多優(yōu)點，如:生物相容性，靶向性，緩釋性，增加藥物的穩(wěn)定性等。

2.2 脂質(zhì)體的制備方式 傳統(tǒng)的薄膜蒸發(fā)法是脂質(zhì)體制備方法中最基本和應(yīng)用最廣泛的方法[11]，本法簡單，易操作，適合實驗室研究。流感病毒是囊膜病毒，對乙醚，氯仿等有機溶劑均敏感。用薄膜蒸發(fā)被動載藥法制備流感疫苗脂質(zhì)體，它避免了疫苗與有機溶劑的直接接觸。主要存在的問題是工藝的不完善、有機溶劑或表面活性劑的殘留都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物的生物活性降低，而且難以實現(xiàn)大批量脂質(zhì)體的制備[12]。

2.3 脂質(zhì)體理化性質(zhì)對其免疫原性影響 對脂質(zhì)體的主要理化性質(zhì)對脂質(zhì)體流感疫苗免疫原性的影響從機制上進行系統(tǒng)的研究，為脂質(zhì)體作為流感疫苗佐劑的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。經(jīng)過35年以及超過1300個研究，很明顯脂質(zhì)體理化性質(zhì)對其免疫原性影響極為重要。對免疫原性影響較大的包括:

2.3.1 抗原的包被方式。決定抗原釋放速度以及被APC識別的難易[13]。

2.3.2 脂質(zhì)體組成、電荷、粒徑等。能改變脂質(zhì)體藥動學性質(zhì)從而獲得理想的停留和抗原攝取、處理以及遞呈在MHC分子[14-15]。Mann等研究發(fā)現(xiàn)，小粒徑脂質(zhì)體刺激較強烈的Th2應(yīng)答，大徑粒刺激的Th1應(yīng)答較強 (IFN-r及IgG2水平較高)，并能刺激較強的保護性抗體[16]。粒徑大小對抗原向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)運、攝取、加工也至關(guān)重要[17]。大顆粒易被DC攝取，小顆粒向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運，被MP和DC攝取。提示攝取部位與顆粒大小有關(guān)。小顆粒易到達淋巴結(jié)，誘導(dǎo)IgG2抗體、B細胞核CD8+T細胞免疫應(yīng)答[18]。帶正電荷脂質(zhì)體通過與帶負電的細胞膜形成電子對復(fù)合物降低細胞膜的穩(wěn)定性，使抗原能更有效地傳遞到細胞質(zhì)。大顆粒、正電荷脂質(zhì)體被APC吞噬作用強[19]。另外，與陰離子脂質(zhì)體相比，陽離子脂質(zhì)體更易促進DC成熟水平 (由CD83表達)，從而增加DC吞噬作用。大粒徑、陽離子脂質(zhì)體會通過增加抗原在給藥部位的停留，促進DC成熟，從而增強T細胞免疫應(yīng)答[20]。陽離子脂質(zhì)體本身有佐劑效應(yīng)，可以激活A(yù)PC。陽離子脂質(zhì)體某些成分可能能誘導(dǎo)炎性細胞因子的釋放，導(dǎo)致Th1型的免疫反應(yīng)，從而增加APC對抗原的攝取[21-22]。脂質(zhì)膜流動性可通過使用具有不同相變溫度的脂質(zhì)材料來調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，使用具有較高相變溫度的脂質(zhì)材料有利于激發(fā)更強的抗體應(yīng)答[23]。另外，脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)對其包被的抗原的免疫作用也會產(chǎn)生影響，單室脂質(zhì)體激發(fā)IgG是同劑量多室脂質(zhì)體的2倍[24]。脂質(zhì)體的剛性在促進免疫增強上也有影響。Barouche等研究發(fā)現(xiàn)[25]，僅有DSPC的GCSA不激發(fā)免疫應(yīng)答，加入膽固醇增加脂質(zhì)膜剛性后免疫應(yīng)答作用增強。Barouche等研究還發(fā)現(xiàn)，剛性增強及相變溫度升高可刺激機體產(chǎn)生較高的抗體及細胞免疫。

3 脂質(zhì)體疫苗的研究進展

脂質(zhì)體疫苗的研究于近10年非常熱門，1974至2010年，根據(jù)Pubmed統(tǒng)計，有1316個相關(guān)的研究報道，其中一半在近8年[26]。與其它疫苗佐劑相比，脂質(zhì)體作為疫苗佐劑有很多獨到之處:

3.1 安全、耐受 已批準使用的Inflexal V目前已在43個國家使用超過六千萬例，其安全性與耐受性已得到很好證實，此外，目前正在進行的幾個脂質(zhì)體疫苗的臨床使用也證實了具有可接受的低基因反應(yīng)[27]。另外，由于脂質(zhì)體是由一些類細胞膜材料組成，因而可以完全生物降解。

3.2 廣泛性 脂質(zhì)體組成以及脂質(zhì)體制備方法能定制，以達到特定要求的脂質(zhì)體理化性質(zhì)[28]。親水性抗原可包裹于親水區(qū)域或螯合在脂質(zhì)體表面，親脂性抗原包于親脂空間，這使得幾乎所有性質(zhì)的抗原 (包括蛋白質(zhì)、多肽、碳氫化合物、核酸以及小分子半抗原等)，在通過對脂質(zhì)體理化性質(zhì)進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)以適應(yīng)抗原不同分子量大小及電荷，均可被包封，因而得到了廣泛的應(yīng)用。

3.3 靶向性 抗原能否準確靶向抗原呈遞細胞上特定的受體 (如DC上的DC-SIGN)也極為重要[29-30]。在脂質(zhì)材料中加入免疫調(diào)節(jié)劑，如TLR激動劑或其它的PRR激動劑等，能增強特定受體的靶向性。此外，由于脂質(zhì)體的包封以及微粒結(jié)構(gòu)，不僅保護抗原不被降解，而且促進巨噬細胞攝取疫苗抗原[31]。

3.4 緩釋性 可延長抗原或半抗原的作用時間，協(xié)助抗原或半抗原誘導(dǎo)體液免疫和/或細胞免疫。

3.5 可冷凍干燥 經(jīng)研究，以脂質(zhì)體為佐劑的疫苗抗原，凍干后與凍干前相比，其物理性狀及免疫原性均無太大差別。這為減輕脂質(zhì)體疫苗產(chǎn)品冷鏈運輸?shù)膲毫Φ於嘶A(chǔ)。

4 展望

以上是近35年研究比較集中的脂質(zhì)體理化性質(zhì)，它們對免疫原性的影響涉及到其包被的抗原的攝取、轉(zhuǎn)運、處理以及呈遞的各個環(huán)節(jié)。然而由于各理化性質(zhì)之間相互作用，脂質(zhì)體理化性質(zhì)與免疫原性二者之間的關(guān)系很難界定[26]。另外，由于不同研究中使用的脂質(zhì)體組成、抗原種類、免疫途徑、抗原用量及實驗動物種類的不同，使得二者之間的關(guān)系沒有統(tǒng)一可用的標準。

此外，還應(yīng)注意到，佐劑與不同的抗原合用，其非特異性免疫調(diào)節(jié)作用是不可預(yù)知的，因而佐劑的批準是與特定的抗原綁定，而不是作為單獨的佐劑。所以單純脂質(zhì)體作為佐劑的作用機理不可能得到全面的詮釋，也沒有太大的研究價值，除非與特定的抗原綁定在一起研究。此外免疫途徑、抗原用量對特定脂質(zhì)體疫苗免疫原性也有極大影響。

[1]Degen WGJ，Jansen T，Schijns VEJC.Vaccine adjuvant technology:from mechanistic concepts to practical applications [J].Expert Rev.Vaccines，2003，2(2):327-335.

[2]Seong S-Y，Matzinger P.Hydrophobicity:an ancientdamage-associated molecular pattern that Initiates innate immunue reponses [J].Nat.Rev.immunol，2004，4(6):469-478.

[3]管孝鞠，吳玉章.人用疫苗佐劑的研究[J].藥學進展，2001，25(4):207-210.

[4]Degen WG，Jansen T，Schijns VE.Vaccine adjuvant technology:from mechanistic concepts to practical applications [J].Expert Nev Vaccines，2003，2(2):327-335.

[5]Douglas S.Watson，Aaron N.Endsley，Leaf Huang.Design considerations for liposomal vaccines:Influence of formulation parameters on antibody and cellmediated immune responses to liposome associated antigens.Vaccine，2012，30(13):2256-2272.

[6]Allison AC，Gregoriadis G.Liposomes as immunological adjuvants.Nature，1974，252(5480):252.

[7]Gregoriadis G，Allison AC.Entrapment of proteins in liposomes prevents allergic reactions in pre-immunised mice.FEBS Lett，1974，45(1):71–74.

[8]Henriksen-Lacey M，Korsholm KS，Andersen P，Perrie Y，Christensen D.Liposomal vaccine delivery systems.Expert Opin Drug Deliv，2011，8(4):505–519.

[9]Gregoriadis G，Gursel I，Gursel M，McCormack B.Liposomes as immunological adjuvants and vaccine carriers.J Controlled Release，1996，41(1–2):49–56.

[10]Alving C，Rao M.Lipid A and liposomes containing lipid A as antigens and adjuvants.Vaccine，2008，26(24):3036–3045.

[11]Wang C Y，Yughes K W，Huang L.Improved cytoplasmic delivery to plant protoplasts via PH2sensitive liposome [J].Plant Physiol，1986，8(2):179-186.

[12]Peter W，Sosaku I.Enzymes inside lipid vesicles:preparation，reactivity and applications[J].Biomol Eng，2001，18(4):143-177.

[13]Therien HM，Lair D，Shahum E.Liposomal vaccine:in?uence of antigen association on the kinetics of the humoral response.Vaccine，1990，8(6):558–562.

[14]Henriksen-Lacey M，Christensen D，Bramwell VW，et al.Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response.J Control Release，2010，145:102-108.

[15]Ahsan F，Rivas IP，Khan MA，et al.Targeting to macrophages:role of physicochemical properties of particulate carriers-liposomes and microspheres-on the phagocytosis by macrophages.J Control Release，2002，79:29-40.

[16]Mann JFS，Shakir E，Carter KC，et al.Lipid vesicle size of an oral influenza vaccine delivery vehicle influences the Th1/Th2 bias in the immune response and protection against infection.Vaccine，2009，27:3643-3649.

[17]Oussoren C，Zuidema J，Crommelin DJA，et al.Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneous injection.II.Influence of liposomal size，lipid composition and lipid dose.Biochim Biophys Acta，1997，1328:261-272.

[18]Bachmann MF，Jennings GT.Vaccine delivery:a matter of size，geometry，kinetics and molecular patterns.Nat Rev Immunol，2010，10:787-796.

[19]Thiele L，Rothen-Rutishauser B，Jilek S，et al.Evaluation of particle uptake in human blood monocyte-derived cells in vitro.Does phagocytosis activity of dendritic cells measure up with macrophages.J Control Release，2001，76:59-71.

[20]Steinman RM.Dendritic cells in vivo:a key target for a new vaccine science.Immunity，2008，29:319-24.

[21]Brandt L，Elhay M，Rosenkrands I，Lindblad EB，Andersen P.ESAT-6 subunit vaccination against mycobacterium tuberculosis.Infect.Immun，2000，68(2):791-795.

[22]Casella C，Mitchell T.Putting endotoxin to work for us:Monophosphoryl lipid A as a safe and effective vaccine adjuvant.Cell.Mol.Life Sci，2008，65(20):3231-3240.

[23]van Houte AJ，Snippe H，Schmitz MG，Willers JM.Characterization of immunogenic properties of haptenated liposomal model membranes in mice.V.Effect of membrane composition on humoral and cellular immunogenicity.Immunology，1981，44(3):561–568.

[24]Shek P，Heath T.Immune response mediated by liposome-associated protein antigens.III.Immunogenicity of bovine serum albumin covalently coupled to vesicle surface.Immunology，1983，50(1):101–106.

[25]Bakouche O，Gerlier D.Enhancement of immunogenicity of tumour virus antigen by liposomes:the effect of lipid composition.Immunology，1986，58(3):507–513.

[26]Douglas S.Watson，Aaron N.Endsley，Leaf Huang.Design considerations for liposomal vaccines:Influence of formulation parameters on antibody and cellmediated immune responses to liposome associated antigens.Vaccine，2012，30(13):2256-2272.

[27]Herzog C，Hartmann K，Kunzi V，Kursteiner O，Mischler R，Lazar H，et al.Eleven years of In?exal V-a virosomal adjuvanted in?uenza vaccine.Vaccine，2009，27(33):4381–4387.

[28]Szoka Jr F，Papahadjopoulos D.Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles(liposomes).Annu Rev Biophys Bioeng，1980，9:467–508.

[29]Bonifaz L，Bonnyay D，Mahnke K，Rivera M，Nussenzweig MC，Steinman RM.Ef?cient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+T cell tolerance.J Exp Med，2002，196(12):1627–1638.

[30]Tacken PJ，de Vries IJ，Torensma R，F(xiàn)igdor CG.Dendritic-cell immunotherapy:from ex vivo loading to in vivo targeting.Nat Rev Immunol，2007，7(10):790–802.

[31]De haan A，Geerligs AJ，Auchshorn JP.et al.Mucosal immuno-adjuvant activity of liposomes:induction of systemic IgG and secretary IgA responses in mice by intranasal immunization with an influenza subunit vaccine and coadministered liposomes [J].Vaccine，1995，13:155-162.