芹菜黃酮合成酶Ⅰ基因的克隆與序列分析

陳逸云， 王 楓， 徐志勝， 譚國飛， 李夢瑤， 熊愛生

(南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，園藝學院，江蘇南京210095)

芹菜(Apium graveolens)為傘形科(Umbelliferae)芹屬中一、二年生草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸的沼澤地帶，世界各國已普遍栽培。芹菜富含蛋白質、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素等，具有食用、藥用價值，是中國重要的蔬菜之一。

黃酮類化合物是一種小分子酚類物質，廣泛存在于植物界，具有多種生物功能，是一類生物活性很強的化合物，在植物抗病蟲中起重要的作用［1-4］。黃酮類化合物還是一種天然的抗氧化劑，在抗癌、防癌等方面也有顯著效果［5］。植物中主要存在2種黃酮合成酶，即黃酮合成酶I(FSⅠ)和黃酮合成酶Ⅱ(FSⅡ)。FSⅠ是可溶性的，它是2-氧代戊二酸依賴的酶［6］;FSⅡ屬于細胞色素P450單氧化酶，催化反應依賴于 NADPH［7-8］。目前為 止，已 在 茶 樹［9］、大 豆［10］、馬 鈴 薯［11］、苜蓿［12］、高粱［13］、水稻［14］等植物中分離出多種黃酮類化合物合成酶的相關基因。

本試驗分別從3個芹菜材料六合黃心芹、津南實芹和美國西芹中克隆芹菜黃酮合成酶 I基因Ag-FS I，對其序列進行分析，為深入研究芹菜黃酮合成酶的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、菌株、質粒

本試驗選用的芹菜材料六合黃心芹、津南實芹和美國西芹均保存在本實驗室，種植于南京農(nóng)業(yè)大學江浦基地和南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室人工氣候室。取用部位為芹菜的嫩葉部。

大腸桿菌菌株DH5α由本實驗室保存;質粒載體 pMD18-T vector、分子量 Marker、Ex-Taq聚合酶和各類限制性內切酶均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 芹菜DNA的提取 芹菜DNA的提取采用CTAB 法［15］。

1.2.2 芹菜AgFS I基因的克隆 根據(jù)GenBank中旱芹的FS I基因(登錄號:AY817676)設計1對引物(NXR45:5'-ATGGCTCCATCAACTATAACTG-3';NXR46:3'-TCATATCTTCATCTTGGCCTTCTC-5')。分別以六合黃心芹、津南實芹和美國西芹的DNA為模板進行PCR擴增，反應條件為:94℃ 5 min;94℃30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進行凝膠電泳，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收。PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌菌株DH5α

提取質粒，經(jīng)PCR鑒定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 芹菜AgFS I基因序列分析 芹菜AgFS I基因序列全長拼接及氨基酸翻譯采用bioXM 2.6軟件［16］;氨基酸比對及多重比較、氨基酸疏水/親水性鑒定等采用DNAMAN軟件。用NJ法構建分子系統(tǒng)進化樹，用MEGA 5生成報告圖形［17］。利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序進行同源性計算，用網(wǎng)站(http://www.expasy.org)相關軟件進行氨基酸成分、蛋白質分子量、等電點等分析［18］。蛋白質空間結構模型通過Swiss-Model(http://swiss-model.expasy.org)建立［19］。

2 結果與分析

2.1 芹菜AgFS I基因的克隆

分別以六合黃心芹、津南實芹和美國西芹的DNA為模板進行PCR擴增，得到1 600 bp左右的片段(圖1)。序列測定與分析結果表明，3個芹菜來源的AgFS I基因全長為1 616 bp，其中365～723位置和1 152～1 341位置是內含子區(qū)域。AgFS I含有1 068 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼355個氨基酸(圖2)。三者核苷酸水平上有5個堿基的差異，分別為28位(T/C/T，六合黃心芹/津南實芹/美國西芹，下同)、285 位(T/T/C)、431 位(A/A/G)、511位(A/A/G)、631 位(A/T/T)和1 001位(T/T/C)(圖3);編碼的氨基酸有5個位點的差異，分別為10位(S/P/S)、144位(Y/Y/C)、171位(K/K/E)、211位(M/L/L)和位(V/V/A)(圖4)。

圖1 芹菜AgFS I基因DNA片段電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA fragment of AgFS I gene from A.graveolens

圖2 六合黃心芹AgFS I基因序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AgFS I gene from celery Liuhehuangxinqin

2.2 芹菜AgFS I氨基酸多重序列比對與分析

對芹菜AgFS I基因推導的氨基酸序列進行BLASTp同源性檢索，結果顯示:芹菜AgFS I具有20G-FeII_Oxy保守結構域，屬于20G-FeII_Oxy超級家族(圖5)。芹菜 AgFS I與胡蘿卜(Daucus carotaAAX21536.1)、孜 然 芹 (CuminumcyminumABG78790.1)、蘋果(Malus domesticaAAX89398.1)、沙梨(Pyrus pyrifoliaADP09378.1)、桃(Prunus persicaAEJ88219.1)、茶(Camellia sinensisAAT68774.1)、金花茶(Camellia nitidissimaADZ28514.1)、牡丹(Paeonia suffruticosaAEN71544.1)、芍藥(Paeonia lactifloraAFI71897.1)物種中的FS I具有較高的相似性，相似度達84.45%(圖6)。

2.3 芹菜AgFS I蛋白質氨基酸組成成分、理化性質分析及親水、疏水性質比較

圖3 3種芹菜AgFS I基因序列比對Fig.3 Alignment of gene sequences of AgFS I gene from three cultivars of A.graveolens

選取上述植物，同時增加擬南芥(Arabidopsis thalianaBAD89980.1)、油 菜 (BrassicanapusABF60660.1)、大豆(Glycine sojaACA81445.1)、苜蓿(Medicago truncatulaXP_003629323.1)，共16種不同來源植物，對其FS I蛋白質進行氨基酸組成成分及理化性質分析(表1)。這些植物中的FS I蛋白質殘基數(shù)均在355至368之間，分子量在4.0×104左右，理論等電點在5至6之間，堿性氨基酸與酸性氨基酸的數(shù)量基本持平。脂肪族氨基酸比例較高，芳香族只占7%～8%，蛋白質可溶性預測中不溶蛋白質的比例較高，在49%至65%之間。

另外，對芹菜AgFS I氨基酸序列進行親水性和疏水性分析，結果表明，該合成酶的親水性在氨基酸第23位最強，第42位堿基疏水性最強。整體而言，AgFS I屬于疏水性蛋白(圖7)。

2.4 芹菜AgFS I氨基酸序列的進化樹分析

根據(jù)檢索結果，選取上述植物進行同源性進化比對，構建同源進化樹(圖8)。結果表明，六合黃心芹、津南實芹、美國西芹與同屬于傘形科的胡蘿卜、孜然芹進化關系最近。薔薇科的蘋果、沙梨、桃和山茶科的茶、金茶花在進化關系上也較近，接著是芍藥科的牡丹、芍藥，較遠的是十字花科的擬南芥、油菜和及豆科的大豆、苜蓿。進化關系分析結果顯示，傘形科與薔薇科和山茶科的FSI進化較近。

圖4 3種芹菜AgFS I氨基酸比對Fig.4 Alignment of amino acid sequences of AgFS I from three cultivars of Apium graveolens

圖5 六合黃心芹AgFS I保守域預測Fig.5 Prediction of the conserved domain of AgFS I from celery Liuhehuangxinqin

圖6 芹菜AgFS I氨基酸序列的多重比對Fig.6 Alignment of amino acid sequences of AgFS I from celery and other different plants

表1 不同植物來源的FS I氨基酸組成成分及理化性質分析Table 1 Com position and physico-chemical characterization of amino acid sequences of FS I derived from various

2.5 芹菜AgFS I三級結構預測與分析

六合黃心芹、津南實芹和美國西芹中的AgFS I與擬南芥花色素合成酶的氨基酸一致性大于60%。以擬南芥花色素合成酶空間結構(PDB ID:1gp5)為模型，通過Swiss-Model對六合黃心芹、津南實芹和美國西芹AgFS I三維結構建立模型(圖9)。結果顯示:六合黃心芹、津南實芹和美國西芹與擬南芥花色素合成酶PDB ID:1gp5的氨基酸同源性分別為33.3%、31.4%和33.3%，三維結構相似，主要有3個氨基酸位點不同，分別是第144位(Y/Y/C，六合黃心芹/津南實芹/美國西芹，下同)、第171位(K/K/E)、第211位(M/L/L)，上述氨基酸位點的差異沒有導致芹菜AgFS I空間結構的明顯變化。

3 討論

芹菜是是傘形科重要的蔬菜作物之一，富含蛋白質、碳水化合物、胡蘿卜素、B族維生素、鈣、磷、鐵等，老少兼宜。本試驗選用的3個芹菜品種中，六合黃心芹［20］和津南實芹［21］是中國地方品種，美國西芹［22］來源于美國，三者具有較大地域差別和一定的形態(tài)差異。六合黃心芹是南京市六合區(qū)的地方優(yōu)良品種，株型半直立，株高較矮，葉大、綠色、有光澤，心葉黃綠色，纖維少、清香味濃，品質佳;津南實芹是天津市津南區(qū)選育的優(yōu)良地方品種，一般植株高大，緊湊直立，基本無分枝，葉片肥大，組織充實，風味適口，纖維少，商品性好;美國西芹是從美國引進經(jīng)多代提純選育而成，植株較為高大，株型緊湊，葉片寬厚脆綠、有光澤，組織充實，質地脆嫩、纖維少，品質佳。

圖7 芹菜AgFS I氨基酸序列親水、疏水性質預測Fig.7 Predicted hydrophilic and hydrophobic properties of AgFS I from Apium graveolens

圖8 不同物種的FS I氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of amino acid sequences of FS I from several plant species

圖9 芹菜AgFS I的三維結構建模Fig.9 The structural model of the AgFS I from A.graveolens

本試驗從上述3種芹菜中克隆出的黃酮合成酶I，是植物中合成黃酮類物質的關鍵酶之一［23］。黃酮類物質在植物中廣泛存在，從苔蘚植物到被子植物都含有這類物質，是一類低分子量的多酚類次生代謝產(chǎn)物［24-25］。植物中，黃酮類物質與許多功能有關，是果實和種子顏色的主要顯色物質，能夠保護植物抵御紫外線和防止病源微生物侵襲，調節(jié)植物生長素的運輸，是植物和細菌相互作用中的信號分子，能促進花粉萌發(fā)并且和花粉的育性直接相關［26］。黃酮類化合物是一類生物活性很強的化合物，是一種天然的抗氧化劑［5］。但前人的研究大多集中在黃酮合成酶II上，黃酮合成酶I研究相對較少。序列分析比對結果表明，3種芹菜中AgFS I基因之間核苷酸水平上有5個堿基的差異，編碼的氨基酸有5個位點的差異，這些不同地域來源和類型的芹菜中位點差異可能與芹菜某些特定的生理功能和不同地域進化有關。與其他來源植物FSI氨基酸序列的相似性高，表明FS I具有高度保守性。同源進化樹分析結果顯示，AgFS I與同屬于傘形科的胡蘿卜、孜然芹在進化關系上屬于同一大的分枝，與薔薇科、山茶科FS I的進化關系也較近，而與十字花科、豆科FS I在進化上比較遠，但從進化樹上的長度來看，各科之間的進化是相對保守的。三級結構預測與分析發(fā)現(xiàn)，不同芹菜AgFS I雖然部分氨基酸位點不同，但是其空間結構具有一定的相似性，這種空間結構的相似性可能對于其功能非常重要。

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