茄子SSR遺傳多樣性及其農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

馮英娜， 柳李旺， 劉衛(wèi)東， 王 倩， 崔群香

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;2.金陵科技學(xué)院，江蘇 南京 211169)

茄子(Solanum melongenaL.)亦稱(chēng)落酥、昆侖瓜，是茄科(Solanaceae)茄屬作物，染色體為2n=24，屬于漿果。茄子起源于東南亞熱帶地區(qū)。中國(guó)栽培茄子歷史悠久，品種繁多，是世界上最大的茄子生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。茄子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖、維生素和多種礦質(zhì)元素。另外茄子還含有豐富的維生素P，為蔬菜中最高。茄子藥效顯著，具有清熱、解毒、活血、止痛、利尿、消腫、降低膽固醇等功效［1］。

SSR(Simple sequence repeats)，又稱(chēng)為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(Polymerase chain reaction)為基礎(chǔ)的標(biāo)記。SSR標(biāo)記是眾多分子標(biāo)記技術(shù)中一種較好的方法，它具有共顯性、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好且廣泛分布于全基因組等優(yōu)點(diǎn)［2-8］。目前SSR廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、群體結(jié)構(gòu)分析、基因定位及關(guān)聯(lián)分析等多方面的相關(guān)研究［9-10］，而在茄子上SSR標(biāo)記發(fā)展相對(duì)滯后，目前僅見(jiàn)少量的被應(yīng)用于群體結(jié)構(gòu)分析和基因定位［11-12］。

關(guān)聯(lián)分析是以自然群體為材料，能夠檢測(cè)群體內(nèi)處于連鎖不平衡狀態(tài)的標(biāo)記或候選基因的遺傳變異與特定表型顯著關(guān)聯(lián)的頻率［13-14］。與連鎖分析方法相比，此方法具有三方面優(yōu)點(diǎn):①花費(fèi)時(shí)間少，一般以現(xiàn)有的自然群體為材料，無(wú)需構(gòu)建專(zhuān)門(mén)作圖群體;②可以同時(shí)檢測(cè)同一座位的多個(gè)等位基因;③作圖精度高。關(guān)聯(lián)分析的方法最早用在人類(lèi)遺傳學(xué)，用來(lái)挖掘人類(lèi)的致病基因，應(yīng)用在植物上較晚。關(guān)聯(lián)分析方法目前主要用于小麥、水稻、棉花、大麥、大豆等經(jīng)濟(jì)作物［15-17］。在茄子方面還未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)全基因組進(jìn)行掃描，目的在于初步了解茄子材料的連鎖不平衡現(xiàn)象，本試驗(yàn)采用SSR標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外70個(gè)茄子材料進(jìn)行遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析，旨在為茄子的親本選擇提供依據(jù)，同時(shí)通過(guò)分子標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步探討與形態(tài)和品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為茄子的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)70份國(guó)內(nèi)外茄子材料，于2013年1月份在玻璃溫室進(jìn)行育苗，2013年4月7日定植于金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝實(shí)驗(yàn)站塑料大棚內(nèi)，茄子田間形態(tài)調(diào)查參照李錫香等［18］方法。2013年5～6月份測(cè)定茄子的各個(gè)品質(zhì)指標(biāo)。各材料及來(lái)源詳見(jiàn)表1。

1.2 SSR引物分析

本試驗(yàn)選自的引物來(lái)自 Vilanova等［19］和 Zhu等［20］。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出具有多態(tài)性的SSR引物54對(duì)，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。2013年3月5日取新鮮植株的葉片，采用簡(jiǎn)化CTAB法進(jìn)行DNA提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。PCR總反應(yīng)體系為10.0μl，包括1 × Buffer 1.0 μl，Mg2+0.8 μl，dNTP 0.2 μl，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.1 μl，正、反向引物各0.5 μl，ddH2O 5.9μl，DNA模板1.0μl。PCR程序?yàn)?5℃ 2 min，94 ℃ 40 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1min，32 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色拍照［21］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用人工讀膠的方法，有帶的讀1，無(wú)帶的讀0，不確定的記為-9.以NTSYS-pc Ver.2.10計(jì)算遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)并按非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA)和SHAN程序聚類(lèi)分析。基因頻率和Shannon指數(shù)通過(guò)Popgene32進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以Structure 2.3.4軟件［22］進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析，估計(jì)最佳群體組群數(shù)K，其取值范圍為1～10，將MCMC(Markov chain monte carlo)開(kāi)始時(shí)的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為100 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次，迭代次數(shù)(Number of iterations)設(shè)置為5，計(jì)算Q參數(shù)，將其作為協(xié)變量。采用 TASSEL 2.0［23］中的 GLM(General linearmodel)模型結(jié)合分子標(biāo)記數(shù)據(jù)、群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記-性狀的關(guān)聯(lián)分析，確定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)［24］。

2 結(jié)果

2.1 分子標(biāo)記多態(tài)性分析

從供試材料中選擇6個(gè)表型差異大的材料對(duì)68對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，從中選出擴(kuò)增條帶清晰，重復(fù)性好，多態(tài)性豐富的SSR引物18對(duì)，共檢測(cè)到130個(gè)等位變異，平均每個(gè)引物7.2個(gè)等位變異，變化范圍2～9個(gè)等位變異。等位變異最多的標(biāo)記為CSM44(圖1)，共檢測(cè)到9個(gè)等位變異，其次是CSM40，檢測(cè)到7個(gè)等位變異?；蚨鄻有灾笖?shù)和Shannon指數(shù)變幅分別為0.070 0～0.404 4和0.103 6～0.584 8，平均值分別為0.181和0.263。大多數(shù)材料的遺傳相似系數(shù)分布在0.61至0.82之間，這表明不同茄子材料之間有一定差異，但差異不大，遺傳背景較窄。

2.2 聚類(lèi)分析

利用18對(duì)SSR引物對(duì)茄子材料進(jìn)行鑒定，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果(圖2)顯示，在相似系數(shù)0.61處將70份材料分為6大類(lèi)。第1類(lèi)包含3個(gè)材料，果萼色都為綠色。第2類(lèi)包含36個(gè)材料，在相似系數(shù)0.64處可進(jìn)一步分為2個(gè)亞類(lèi)，第1亞類(lèi)主要是長(zhǎng)茄，包括9份國(guó)內(nèi)長(zhǎng)茄、2份荷蘭長(zhǎng)茄、1份日本長(zhǎng)茄、3份國(guó)內(nèi)圓茄和1份日本圓茄。第2亞類(lèi)主要以紫茄為主，14份國(guó)內(nèi)紫茄、4份日本紫茄、2份國(guó)內(nèi)綠茄。第3類(lèi)包括19份材料，在相似系數(shù)0.6處又可分為2個(gè)亞類(lèi)，第1亞類(lèi)只有45號(hào)果色為白色，其他均為紫色或者是紫黑。第2亞類(lèi)均為紫色，主要以國(guó)內(nèi)茄為主，12份國(guó)內(nèi)茄、1份菲律賓茄、1份日本茄。第4類(lèi)主要是長(zhǎng)茄，果萼色均為綠紫。第5類(lèi)為62號(hào)扁紅茄，來(lái)自于非洲，果色橘紅色，野生種。第6類(lèi)是果萼色為綠紫，果色都是鮮紫。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為了消除關(guān)聯(lián)分析時(shí)由于供試材料群體結(jié)構(gòu)引起的偽關(guān)聯(lián)，根據(jù)Evanno等［25］的方法，利用18對(duì)引物對(duì)70個(gè)供試材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)檢測(cè)，結(jié)果顯示該群體可分為5個(gè)亞群，分別為POP1、POP2、POP3、POP4和POP5。根據(jù)每個(gè)亞類(lèi)群中主要顏色所占的比例(Q值)，將Q＞0.6視為血緣單一，Q＜0.6視為具有混合來(lái)源［26］，分析不同基因型個(gè)體在相應(yīng)亞類(lèi)群中的遺傳背景(圖3)。結(jié)果顯示，各亞類(lèi)群間存在明顯的差異。POP1亞類(lèi)群(紅色)包括16份材料，主要以紫色茄為主，各部分材料Q值均大于0.6，表明種質(zhì)來(lái)源單一，遺傳背景不復(fù)雜，同其他類(lèi)群缺少基因交流。POP2亞類(lèi)群(綠色)由29份材料組成，果萼色以綠紫為主，有8份材料Q值都在0.6以下，表明其具有混合來(lái)源，遺傳背景較復(fù)雜，如傾國(guó)69含有較多的POP1遺傳背景，主力長(zhǎng)茄品種含有較多的POP5遺傳背景。萬(wàn)壽龍品種含有較多的POP4、POP5遺傳背景。POP3亞類(lèi)群(藍(lán)色)，由15份材料構(gòu)成，以長(zhǎng)筒茄為主。其中有8份材料遺傳背景復(fù)雜，按Q值從大到小依次為西方神茄、麗華、艷麗長(zhǎng)、尼爾、扁紅茄、美引茄冠、蘇崎茄、紫塔號(hào);從外形來(lái)看，果形、果萼色不同，基因交流較頻繁。POP4亞類(lèi)群(黃色)，由7份國(guó)內(nèi)長(zhǎng)茄組成，其中4份材料來(lái)源于西南地區(qū)，其混合來(lái)源單一。POP5亞類(lèi)群(淺紫色)，包括3份材料，果色為黑紫色。

圖2 SSR標(biāo)記的70份材料的UPGMA聚類(lèi)圖Fig.2 Dendrogram of 70 eggplant varieties analyzed by SSR-UPGMA based on genetic similarities

2.4 SSR標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

本研究檢測(cè)的18對(duì)SSR引物，有13對(duì)引物的17個(gè)位點(diǎn)與測(cè)試性狀相關(guān)聯(lián)。結(jié)果(表2)顯示，其中與葉柄長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有5個(gè)，與單果質(zhì)量、可溶性蛋白質(zhì)、蘆丁、果色、果萼色5個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)各3個(gè)，與株型、首花節(jié)位、可溶性糖3個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)各有2個(gè)，其余的性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)只有1個(gè)。其中位點(diǎn)CSM44-1是關(guān)聯(lián)性狀最多的位點(diǎn)，與首花節(jié)位、果形、單果質(zhì)量、葉柄長(zhǎng)4個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)，對(duì)4個(gè)性狀的變異解釋率分別為46.0%、50.1%、47.5%、42.3%。位點(diǎn)CSM33-5、CSM65-3是關(guān)聯(lián)性狀最少的位點(diǎn)，分別與株高、可溶性固形物關(guān)聯(lián)，對(duì)其變異解釋率分別為21.1%、24.7%。位點(diǎn)CSM40-6、CSM47-2、CSM71-6分別與蘆丁、葉柄長(zhǎng)、果萼色極顯著相關(guān)(P＜0.01)，其變異解釋率分別達(dá)到43.2%、29.8%、26.5%。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)位點(diǎn)與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)和多個(gè)位點(diǎn)與同一性狀相關(guān)聯(lián)的情況很普遍。原因可能是蔬菜的許多重要的農(nóng)藝性狀均屬于由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀。

3 討論

3.1 茄子遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

分子標(biāo)記是鑒定茄子材料親緣關(guān)系有效途徑之一。本研究用SSR對(duì)70份茄子材料遺傳多樣性分析，在一定程度上反應(yīng)了70份材料直接的親緣關(guān)系，聚類(lèi)分析的遺傳相似系數(shù)大多數(shù)在0.56～0.93，平均相似系數(shù)在0.68，在分子水平上遺傳差異不大，這與前人的研究結(jié)果一致［12，27］。在茄子的育種過(guò)程中，育種工作者應(yīng)繼續(xù)努力拓寬茄子的遺傳基礎(chǔ)，解決遺傳背景狹窄問(wèn)題，為茄子品種選育提供豐富的親本。

將群體結(jié)構(gòu)所得的Q值作為協(xié)變量代入回歸分析。以消除供試材料群體結(jié)構(gòu)的偽關(guān)聯(lián)，確保關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性［28-29］。本研究基于SSR標(biāo)記，利用Structure2.3.4軟件的群體結(jié)構(gòu)分析將70個(gè)材料分為5個(gè)亞類(lèi)群。其中POP1亞類(lèi)群主要是國(guó)內(nèi)茄，只有4份國(guó)外茄子材料，可能是頻繁的商業(yè)化導(dǎo)致基因之間的交流。表明茄子群體結(jié)構(gòu)的劃分與來(lái)源有一定的關(guān)系。這和肖熙歐等［30］、孫源文等［31］的研究比較吻合。POP2亞類(lèi)群主要是紫茄(紫黑、鮮紫、紫紅)。扁圓茄、圓球茄、高圓茄分布在POP1、POP2、POP3、POP5亞類(lèi)群中，可能是沒(méi)有篩選到合適的引物將他們分在一起。長(zhǎng)條茄、長(zhǎng)羊角茄、長(zhǎng)筒茄主要分布在POP1、POP2、POP3 3個(gè)亞類(lèi)群，這與傳統(tǒng)的Bailey［32］茄子分類(lèi)相符。本試驗(yàn)部分材料是國(guó)外引進(jìn)的品種，但和中國(guó)的材料遺傳系數(shù)較高，可能是育種工作者的育種目標(biāo)相同，導(dǎo)致遺傳背景相似。其次利用SSR標(biāo)記進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，必須要有足夠的多態(tài)性位點(diǎn)能覆蓋較全的基因組，才能提高群體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，但同其他標(biāo)記相比，SSR引物產(chǎn)生的多態(tài)性較低，且研究中所使用SSR數(shù)目有限，使得結(jié)果可能產(chǎn)生誤差。

表2 與農(nóng)藝相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)Table 2 SSR loci significantly associated with agronom ic traits in eggplant

3.2 茄子SSR分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析(Association analysis)，又稱(chēng)關(guān)聯(lián)作圖(Association mapping)，首次將關(guān)聯(lián)分析用于植物上的是Hansen等［33］對(duì)野生甜菜生長(zhǎng)習(xí)性的研究。其發(fā)現(xiàn)在17個(gè)引物組合擴(kuò)增的440個(gè)全基因組范圍內(nèi)的AFLP引物中，有2個(gè)位點(diǎn)與控制抽薹前是否需要春化的B基因顯著關(guān)聯(lián)。目前關(guān)聯(lián)分析在作物方面主要用在小麥、玉米、水稻、棉花等。印志同等［34］采用71對(duì)SSR引物掃描85份糯玉米自交系材料進(jìn)行耐鹽性鑒定，共檢測(cè)到9個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)分別與5個(gè)耐鹽性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中1個(gè)位點(diǎn)同時(shí)與2個(gè)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。王艷平等［35］用45份材料構(gòu)成的品種群體對(duì)38個(gè)特異性、一致性、穩(wěn)定性(DUS)測(cè)試性狀與45個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，20個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)與23個(gè)DUS測(cè)試性狀相關(guān)聯(lián)。本研究在18對(duì)引物上共檢測(cè)13對(duì)引物的17個(gè)位點(diǎn)與茄子的14個(gè)數(shù)量性狀相關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。其中位點(diǎn)CSM21-4、CSM47-3、CSM63-5與果色顯著相關(guān)，變異解釋率分別為28.4%、19.2%、26.7%。

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