亞硒酸鈉對(duì)鼠胚胎干細(xì)胞及奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

張寶修， 尹 多， 姜園園， 孫婧陶， 李鐘淑， 方南洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，吉林 延吉 133000)

胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)是未分化的具有全能性的干細(xì)胞，能夠在體外增殖［1-3］。由于胚胎干細(xì)胞與胚胎生長(zhǎng)特性比較接近，胚胎干細(xì)胞早期在子宮內(nèi)的代謝特點(diǎn)，因此以胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞有著很大優(yōu)勢(shì)。但胚胎干細(xì)胞只有在含氧1%～5%條件下才能生長(zhǎng)良好。在含氧量低的條件下，胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化會(huì)受到阻礙，并且能維持多功能性［4］，由于體外培養(yǎng)含氧量較高，所以胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件要求較高。一些細(xì)胞在低氧條件下不能得到氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP，必須依靠線粒體產(chǎn)生的ATP來(lái)滿足能量的需求［5］，而胚胎干細(xì)胞在含氧較低條件下仍能很好的增長(zhǎng)并能保持細(xì)胞多功能性。但在含氧較低的子宮頸部分只有少量的不成熟的線粒體［6-7］，因此有些細(xì)胞ATP能量的供應(yīng)會(huì)受到阻礙，克隆胚胎發(fā)育受阻，胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞有利于胚胎發(fā)育，并且也能夠起到保障大量基因遺傳。試驗(yàn)結(jié)果表明，分化干細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)量有所增加并且形態(tài)上也更為類似［7］，胚胎干細(xì)胞可以描述胚胎分化的一個(gè)階段并可提供一個(gè)檢測(cè)早期線粒體代謝動(dòng)態(tài)變化的模型。細(xì)胞通過(guò)線粒體電子運(yùn)輸系統(tǒng)產(chǎn)生大量的ATP，氧化磷酸化會(huì)產(chǎn)生氧化產(chǎn)物［8］。這些代謝產(chǎn)物可能含有活性氧，活性氧可能參與胚胎生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)等。但這些氧化產(chǎn)物過(guò)量積累，胚胎抗氧化保護(hù)機(jī)制不足，胚胎發(fā)育會(huì)受到阻礙。胚胎對(duì)氧化損傷很敏感［9］，胚胎對(duì)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)擁有一個(gè)有效的抗氧化系統(tǒng)［10］。體外成熟或體外受精僅僅擁有自身抗氧化系統(tǒng)是不夠的，因此需要外源性抗氧化劑的加入。硒是內(nèi)源性抗氧化劑，亞硒酸鈉(Sodium selenite，SS)是清除細(xì)胞內(nèi)自由基的一種外源性抗氧化劑。觀察亞硒酸鈉在異種重構(gòu)胚胎各個(gè)時(shí)期抗氧化性，有利于體外胚胎發(fā)育率的提高，為體細(xì)胞克隆胚胎抗氧化機(jī)制研究做基礎(chǔ)。

由于誘導(dǎo)異種重構(gòu)胚獲得胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用上的排斥反應(yīng)會(huì)大大減少等諸多原因，例如，來(lái)自異種胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞用于皮膚移植排斥反應(yīng)遠(yuǎn)小于同種胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞。誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化在近年來(lái)實(shí)際應(yīng)用比較廣泛。但是胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用中危險(xiǎn)性并未真正得到證實(shí)，是否會(huì)帶來(lái)后遺癥并沒(méi)有得到驗(yàn)證。胚胎干細(xì)胞作為供核細(xì)胞抗氧化相關(guān)研究并不是很多，胚胎干細(xì)胞具有全能性，在抗氧化方面研究也就更有實(shí)際意義。

近些年來(lái)，由于稀有動(dòng)物種類的不斷增加，因此在核移植科學(xué)方面上卵母細(xì)胞的供應(yīng)也越來(lái)也越少。構(gòu)思利用異種重組得到囊胚，獲得胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)成能夠生育的卵母細(xì)胞的方法將會(huì)在今后人類不孕不育上做出突出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)用小鼠為良種肉牛選育中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。從中選取6～8周齡的雌性小白鼠50只以及10周以上的雄性小白鼠15只。

乙二胺四乙酸(EDTA)、谷氨酰胺、乳酸鈉、葡萄糖、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、礦物油、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2、酚紅、高糖 DMEM、絲裂霉素C、白細(xì)胞抑制因子(LIF)等均購(gòu)自Sigma;胎牛血清購(gòu)自四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的獲得及飼養(yǎng)層的制備 取妊娠13.5 d的小白鼠，用無(wú)菌方法解剖小鼠得到胚胎，將胚胎取下之后放在含有D-PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。去除胚胎頭部、四肢和內(nèi)臟，用DPBS清洗3次或更多次。用無(wú)菌外科刀將其胚胎剪碎至1 mm3的小塊。移到無(wú)菌錐形瓶中，加入5 ml的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA，在37℃的培養(yǎng)箱中消化30 min，加入10 ml的含有10%FBS的DMEM終止消化。將其過(guò)濾，濾液以1 000 r/min、7 min進(jìn)行離心。棄上清液，向離心管中加入1 ml含有20%FBS的DMEM，重懸細(xì)胞后移入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。

待胎兒皮膚成纖維細(xì)胞純化后，用含有10%FBS、10μg/m l絲裂霉素C的無(wú)菌DMEM處理成纖維細(xì)胞，放在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h。再用 PBS清洗2次，用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA消化2 min，收集細(xì)胞后低速離心(1 000 r/min、7min)，去上清液，加入新鮮的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。以密度為1 m l 2×105個(gè)接種到96孔板中，作為飼養(yǎng)層細(xì)胞待用。

1.2.2 囊胚中胚胎干細(xì)胞的分離 囊胚來(lái)自經(jīng)過(guò)超排、交配后3.5 d的小白鼠。無(wú)菌腹部取下子宮(連接輸卵管)，用室溫下的M2培養(yǎng)液沖洗子宮，將單個(gè)胚胎置于含有飼養(yǎng)層的96培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔加入300μl的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(含白細(xì)胞抑制因子)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。囊胚培養(yǎng)12 h之后，用拉成的細(xì)針從滋胚層將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)挑出，用D-PBS清洗2次，將細(xì)胞團(tuán)移到礦物油覆蓋的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA中，在37℃下孵育3～4 min后移到含血清的培養(yǎng)基中并輕輕吹散，使其成為有3～5個(gè)細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán)，不要分成單個(gè)細(xì)胞。將小滴內(nèi)的所有內(nèi)含物移到制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每天進(jìn)行觀察，2 d后可以見(jiàn)到小的克隆細(xì)胞，即胚胎干細(xì)胞。

囊胚培養(yǎng)12 h后，用PBS清洗3次，分別用濃度10μg/ml的Hoechst33342和10μg/ml碘化丙啶在37℃染色15 min(注意避光)，染色結(jié)束后用PBS清洗2次，封片，在熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。

1.2.3 胚胎干細(xì)胞過(guò)氧化氫氧化損傷最適濃度的篩選 使用外源性過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激刺激并建立模型，測(cè)出不同濃度的H2O2對(duì)胚胎干細(xì)胞的氧化損傷狀況，以確定建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA對(duì)細(xì)胞消化3 min，PBS清洗3次(速度要快，防止分化)，以每孔1×102～5×102個(gè)胚胎干細(xì)胞接種到96孔板，每孔細(xì)胞匯合長(zhǎng)至80%加入200μl胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。分別配制0 μmol/L(對(duì) 照)、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L、150 μmol/L濃度的 H2O2，加入到胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4.5 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配)20μl繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。使用酶標(biāo)儀(選擇490 nm波長(zhǎng))，測(cè)出OD值。處理組的OD值與對(duì)照組的OD值的比值是增殖率。以細(xì)胞增殖率50% ～60%為建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。

1.2.4 亞硒酸鈉對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 將最適濃度的H2O2作用于細(xì)胞4.5 h后，再分別向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0μmol/L(對(duì)照)、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和5.5μmol/L不同濃度亞硒酸鈉。用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。

1.2.5 不同來(lái)源供核細(xì)胞的重構(gòu)胚發(fā)育率的比較 分別用小鼠胚胎干細(xì)胞和胎兒皮膚成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞。超數(shù)排卵3只小白鼠后采用背部取輸卵管，去掉卵丘細(xì)胞后取出帶有第一極體的卵母細(xì)胞，放在細(xì)胞松弛素B的小滴中，采用擠壓法進(jìn)行去核。將供體細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化后，挑選細(xì)胞質(zhì)生長(zhǎng)均勻，質(zhì)量好的細(xì)胞做為供核細(xì)胞。將供核細(xì)胞注入到卵母細(xì)胞的卵黃周隙中，以便融合。使用直流電脈沖融合后用濃度5μmol/L的離子霉素對(duì)重構(gòu)胚進(jìn)行預(yù)激活5 min，之后移入到2 mmol/L的二甲基氨基嘌呤激活4 h。激活之后放入平衡好的培養(yǎng)液小滴中進(jìn)行培養(yǎng)，72 h進(jìn)行半量換液，每隔24 h進(jìn)行觀察記錄發(fā)育率。

1.2.6 亞硒酸鈉處理對(duì)過(guò)氧化氫氧化損傷下胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育率的影響 用最適濃度的H2O2和亞硒酸鈉處理小鼠胚胎干細(xì)胞，培養(yǎng)14 d后細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%可做為供核細(xì)胞，生產(chǎn)重構(gòu)胚，并比較其發(fā)育率。

1.2.7 奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚的構(gòu)建 以延邊奶山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞做為供核細(xì)胞，來(lái)生產(chǎn)異種重構(gòu)胚，并記錄發(fā)育率。重構(gòu)胚獲取方法同方法1.2.5。

1.2.8 異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量的檢測(cè) 將胚胎從培養(yǎng)液中取出，用PBS清洗3次，置于濃度為10 μg/ml的DCFH-DA染色液小滴中，避光染色37℃15 min。PBS清洗2次。熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。熒光圖片用Image-6.0軟件進(jìn)行量化分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析的方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 胚胎干細(xì)胞的獲得

囊胚在培養(yǎng)12 h之后，分別用Hoechst 33342和PI在37℃染色可以清晰的看到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(圖1)，獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在飼養(yǎng)層上進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4 d的克隆培養(yǎng)得到大量的胚胎干細(xì)胞。

2.2 亞硒酸鈉對(duì)胚胎干細(xì)胞抗氧化損傷的影響

圖1 囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)Fig.1 Inner cellmass of blastocyst

在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入0μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L和 150 μmol/L濃度的H2O2，以不添加H2O2對(duì)照組細(xì)胞增殖率為100%。結(jié)果顯示:30μmol/L、60μmol/L、90 μmol/L H2O2處理的細(xì)胞增殖率顯著高于 120 μmol/L、150 μmol/L H2O2處理(P＜0.05)(圖 2)。當(dāng)H2O2濃度為90μmol/L時(shí)，胚胎干細(xì)胞增殖率降低至50% ～60%。因此，90μmol/L H2O2為最適合建立過(guò)氧化氫氧化損傷模型的濃度。

圖2 不同濃度的過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)胚胎干細(xì)胞的氧化損傷Fig.2 Oxidative damage of embryonic stem cell caused by different concentrations of hydrogen peroxide(H 2O 2)

90μmol/L H2O2處理胚胎干細(xì)胞4.5 h后，分別向培養(yǎng)基中加入 0μmol/L、1.5μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和 5.5 μmol/L亞硒酸鈉，結(jié)果顯示，3.5μmol/L亞硒酸鈉處理的細(xì)胞增殖率顯著高于其他處理(P＜0.05)，且 1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、4.5 μmol/L、5.5 μmol/L亞硒酸鈉處理間無(wú)顯著性差異(圖3)。表明亞硒酸鈉對(duì)90μmol/L H2O2氧化應(yīng)激的最佳保護(hù)濃度則為3.5 μmol/L。

圖3 不同濃度的亞硒酸鈉對(duì)過(guò)氧化氫氧化損傷下胚胎干細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of different concentrations of sodiumselenite on embryonic stem cells oxidated by H2 O2

2.3 亞硒酸鈉對(duì)不同來(lái)源供核細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

采用生長(zhǎng)良好的小鼠胚胎干細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞做為供核細(xì)胞，生產(chǎn)重構(gòu)胚，統(tǒng)計(jì)其發(fā)育率(表1和圖4)。數(shù)據(jù)顯示，在培養(yǎng)2 d后胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚的胚胎卵裂率顯著高于成纖維細(xì)胞重構(gòu)胚的胚胎卵裂率(P＜0.05)，但兩組間的囊胚率差異不顯著。經(jīng)亞硒酸鈉處理的胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚卵裂率顯著高于未處理的卵裂率(P＜0.05)，兩組間的囊胚率差異也顯著(P＜0.05)。

表1 不同來(lái)源供核細(xì)胞重構(gòu)胚的發(fā)育率Table 1 Developmental efficiency of embryonic stem cells of nuclei from different somatic cells

圖4 小鼠胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚的產(chǎn)生過(guò)程Fig.4 The process of reconstructed embryos production from embryonic stem cells

2.4 亞硒酸鈉對(duì)延邊奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

結(jié)果(表2)顯示，延邊奶山羊成纖維細(xì)胞構(gòu)成的異種重構(gòu)胚卵裂率和囊胚率顯著低于小鼠成纖維細(xì)胞構(gòu)成的重構(gòu)胚(P＜0.05)。添加亞硒酸鈉濃度為5 ng/ml［11］異種重構(gòu)胚卵裂率顯著高于未添加亞硒酸鈉異種重構(gòu)胚卵裂率(P＜0.05)，囊胚率差異不顯著。

表2 延邊奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚的發(fā)育率Table 2 Developmental rates of interspecies reconstructed embryo from Yanbian dairy goat and mouse

2.5 亞硒酸鈉對(duì)異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量的影響

對(duì)2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、桑椹胚內(nèi)部的ROS含量進(jìn)行檢測(cè)，由表3可知，在2-細(xì)胞期，添加亞硒酸鈉的異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量顯著低于未添加亞硒酸鈉處理(P＜0.05);4-細(xì)胞和桑椹胚期，添加亞硒酸鈉的異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量與未添加亞硒酸鈉的差異均不顯著。

表3 胚胎內(nèi)部的ROS含量Table 3 Reactive oxygen species(ROS)content inside embryos

3 討論

在體外，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞條件要求較高，分離培養(yǎng)的過(guò)程也比較復(fù)雜，影響環(huán)節(jié)諸多，要做到培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境盡量保持一致。把胚胎從透明帶中孵出是提取胚胎干細(xì)胞的關(guān)鍵，而輔助孵化技術(shù)有助于體外培養(yǎng)的胚胎從透明帶中孵化出。目前，輔助孵化技術(shù)有:機(jī)械法［12］、酶消化法［13-14］、酸化法和激光輔助孵化法［15］。機(jī)械法容易造成囊胚破裂，實(shí)施難度較大。酸化法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，并且對(duì)細(xì)胞的毒性較大。酶消化法簡(jiǎn)單易行，但是對(duì)胚胎的損傷很大，并且消化后囊胚不容易貼壁。由于胚胎干細(xì)胞是來(lái)自于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并且在移植前有一些代謝特點(diǎn)［16］。比如說(shuō)，在體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞自動(dòng)分化過(guò)程可以為檢測(cè)細(xì)胞從厭氧到需氧過(guò)度的動(dòng)態(tài)性變化提供一個(gè)模型。細(xì)胞就能量供應(yīng)來(lái)說(shuō)氧化磷酸化要優(yōu)于糖酵解［17］。細(xì)胞在體外成熟氧氣較多時(shí)，厭氧代謝途徑終止。正在分化或者已經(jīng)分化了的細(xì)胞在有氧條件下用于氧化磷酸化的線粒體有所增加［18］。據(jù)之前報(bào)道，ROS水平過(guò)高，會(huì)使機(jī)體抗氧化損傷能力下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。濃度過(guò)低，可致細(xì)胞凋亡［19-20］。在細(xì)胞里產(chǎn)生ROS的來(lái)源有多處，但大部分在線粒體［21］。因此，胚胎干細(xì)胞是檢測(cè)抗氧化性的一個(gè)良好平臺(tái)。本試驗(yàn)首先用外源性H2O2對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，之后采用亞硒酸鈉對(duì)胚胎干細(xì)胞的氧化損傷進(jìn)行保護(hù)，測(cè)出細(xì)胞增殖率進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，當(dāng)H2O2濃度為90.0μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率較小，對(duì)胚胎干細(xì)胞氧化損傷較大，為適宜濃度。亞硒酸鈉對(duì)這種氧化應(yīng)激的最佳保護(hù)濃度為3.5μmol/L。

異種重構(gòu)胚技術(shù)，是通過(guò)使用分布比較普遍動(dòng)物的卵母細(xì)胞對(duì)瀕臨滅絕動(dòng)物進(jìn)行重構(gòu)胚，使稀有動(dòng)物得到延續(xù)的一種方法之一。另外還可通過(guò)誘導(dǎo)異種重構(gòu)胚干細(xì)胞分化成卵母細(xì)胞的方法。異種重構(gòu)胚難點(diǎn)在于2個(gè)物種的遺傳距離和物種差異可能導(dǎo)致基因組轉(zhuǎn)錄和翻譯的失敗。優(yōu)化異種重構(gòu)胚的培養(yǎng)體系是提高重構(gòu)胚發(fā)育率的方法之一，異種移植有著特定的重構(gòu)胚體系，從而來(lái)適應(yīng)供體核的移植，核重塑及重編程。供體核的選擇、融合激活策略的不同、培養(yǎng)體系的改變會(huì)對(duì)異種重構(gòu)胚的發(fā)育也有著有很大的影響。供體核代數(shù)的不同有著特異的表達(dá)狀態(tài)［22］和 mRNA 表達(dá)模式［23］可能是重編程較差的原因。試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞得到的重構(gòu)胚要顯著高于同種的體細(xì)胞移植［24］。有研究表明，用人類神經(jīng)干細(xì)胞做為供核細(xì)胞與山羊卵母細(xì)胞獲得了異種重構(gòu)胚［25］。細(xì)胞成熟促進(jìn)因子是促使核膜破裂、染色體凝集，但是細(xì)胞成熟促進(jìn)因子再激活后會(huì)迅速下降到常規(guī)水平。有專家采用卵母細(xì)胞預(yù)先激活［26］和延遲激活［27］的方法提高重構(gòu)胚發(fā)育率。還有研究稱，采用不同培養(yǎng)液(mSOF和 TCM-199)處理喜馬拉雅斑羚-牛的異種重構(gòu)胚培養(yǎng)，結(jié)果mSOF培養(yǎng)液能夠得到囊胚，而TCM-199沒(méi)有獲得囊胚［28］。本試驗(yàn)中，亞硒酸鈉處理的小鼠胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚和延邊奶山羊-鼠胎兒皮膚成纖維細(xì)胞異種重構(gòu)胚的卵裂率顯著高于未經(jīng)亞硒酸鈉處理的胚胎干細(xì)胞。

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