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    亞硒酸鈉對(duì)鼠胚胎干細(xì)胞及奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

    2014-10-11 02:32:00張寶修姜園園孫婧陶李鐘淑方南洙
    關(guān)鍵詞:異種囊胚酸鈉

    張寶修, 尹 多, 姜園園, 孫婧陶, 李鐘淑, 方南洙

    (延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系,吉林 延吉 133000)

    胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell,ESC)是未分化的具有全能性的干細(xì)胞,能夠在體外增殖[1-3]。由于胚胎干細(xì)胞與胚胎生長(zhǎng)特性比較接近,胚胎干細(xì)胞早期在子宮內(nèi)的代謝特點(diǎn),因此以胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞有著很大優(yōu)勢(shì)。但胚胎干細(xì)胞只有在含氧1%~5%條件下才能生長(zhǎng)良好。在含氧量低的條件下,胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化會(huì)受到阻礙,并且能維持多功能性[4],由于體外培養(yǎng)含氧量較高,所以胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件要求較高。一些細(xì)胞在低氧條件下不能得到氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP,必須依靠線粒體產(chǎn)生的ATP來(lái)滿足能量的需求[5],而胚胎干細(xì)胞在含氧較低條件下仍能很好的增長(zhǎng)并能保持細(xì)胞多功能性。但在含氧較低的子宮頸部分只有少量的不成熟的線粒體[6-7],因此有些細(xì)胞ATP能量的供應(yīng)會(huì)受到阻礙,克隆胚胎發(fā)育受阻,胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞有利于胚胎發(fā)育,并且也能夠起到保障大量基因遺傳。試驗(yàn)結(jié)果表明,分化干細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)量有所增加并且形態(tài)上也更為類似[7],胚胎干細(xì)胞可以描述胚胎分化的一個(gè)階段并可提供一個(gè)檢測(cè)早期線粒體代謝動(dòng)態(tài)變化的模型。細(xì)胞通過(guò)線粒體電子運(yùn)輸系統(tǒng)產(chǎn)生大量的ATP,氧化磷酸化會(huì)產(chǎn)生氧化產(chǎn)物[8]。這些代謝產(chǎn)物可能含有活性氧,活性氧可能參與胚胎生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)等。但這些氧化產(chǎn)物過(guò)量積累,胚胎抗氧化保護(hù)機(jī)制不足,胚胎發(fā)育會(huì)受到阻礙。胚胎對(duì)氧化損傷很敏感[9],胚胎對(duì)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)擁有一個(gè)有效的抗氧化系統(tǒng)[10]。體外成熟或體外受精僅僅擁有自身抗氧化系統(tǒng)是不夠的,因此需要外源性抗氧化劑的加入。硒是內(nèi)源性抗氧化劑,亞硒酸鈉(Sodium selenite,SS)是清除細(xì)胞內(nèi)自由基的一種外源性抗氧化劑。觀察亞硒酸鈉在異種重構(gòu)胚胎各個(gè)時(shí)期抗氧化性,有利于體外胚胎發(fā)育率的提高,為體細(xì)胞克隆胚胎抗氧化機(jī)制研究做基礎(chǔ)。

    由于誘導(dǎo)異種重構(gòu)胚獲得胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用上的排斥反應(yīng)會(huì)大大減少等諸多原因,例如,來(lái)自異種胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞用于皮膚移植排斥反應(yīng)遠(yuǎn)小于同種胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞。誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化在近年來(lái)實(shí)際應(yīng)用比較廣泛。但是胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞在實(shí)際應(yīng)用中危險(xiǎn)性并未真正得到證實(shí),是否會(huì)帶來(lái)后遺癥并沒(méi)有得到驗(yàn)證。胚胎干細(xì)胞作為供核細(xì)胞抗氧化相關(guān)研究并不是很多,胚胎干細(xì)胞具有全能性,在抗氧化方面研究也就更有實(shí)際意義。

    近些年來(lái),由于稀有動(dòng)物種類的不斷增加,因此在核移植科學(xué)方面上卵母細(xì)胞的供應(yīng)也越來(lái)也越少。構(gòu)思利用異種重組得到囊胚,獲得胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)成能夠生育的卵母細(xì)胞的方法將會(huì)在今后人類不孕不育上做出突出貢獻(xiàn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    本試驗(yàn)用小鼠為良種肉牛選育中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。從中選取6~8周齡的雌性小白鼠50只以及10周以上的雄性小白鼠15只。

    乙二胺四乙酸(EDTA)、谷氨酰胺、乳酸鈉、葡萄糖、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、礦物油、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2、酚紅、高糖 DMEM、絲裂霉素C、白細(xì)胞抑制因子(LIF)等均購(gòu)自Sigma;胎牛血清購(gòu)自四季青公司。

    1.2 方法

    1.2.1 小鼠胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的獲得及飼養(yǎng)層的制備 取妊娠13.5 d的小白鼠,用無(wú)菌方法解剖小鼠得到胚胎,將胚胎取下之后放在含有D-PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。去除胚胎頭部、四肢和內(nèi)臟,用DPBS清洗3次或更多次。用無(wú)菌外科刀將其胚胎剪碎至1 mm3的小塊。移到無(wú)菌錐形瓶中,加入5 ml的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA,在37℃的培養(yǎng)箱中消化30 min,加入10 ml的含有10%FBS的DMEM終止消化。將其過(guò)濾,濾液以1 000 r/min、7 min進(jìn)行離心。棄上清液,向離心管中加入1 ml含有20%FBS的DMEM,重懸細(xì)胞后移入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。

    待胎兒皮膚成纖維細(xì)胞純化后,用含有10%FBS、10μg/m l絲裂霉素C的無(wú)菌DMEM處理成纖維細(xì)胞,放在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 h。再用 PBS清洗2次,用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA消化2 min,收集細(xì)胞后低速離心(1 000 r/min、7min),去上清液,加入新鮮的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。以密度為1 m l 2×105個(gè)接種到96孔板中,作為飼養(yǎng)層細(xì)胞待用。

    1.2.2 囊胚中胚胎干細(xì)胞的分離 囊胚來(lái)自經(jīng)過(guò)超排、交配后3.5 d的小白鼠。無(wú)菌腹部取下子宮(連接輸卵管),用室溫下的M2培養(yǎng)液沖洗子宮,將單個(gè)胚胎置于含有飼養(yǎng)層的96培養(yǎng)板孔內(nèi),每孔加入300μl的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(含白細(xì)胞抑制因子),置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。囊胚培養(yǎng)12 h之后,用拉成的細(xì)針從滋胚層將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)挑出,用D-PBS清洗2次,將細(xì)胞團(tuán)移到礦物油覆蓋的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA中,在37℃下孵育3~4 min后移到含血清的培養(yǎng)基中并輕輕吹散,使其成為有3~5個(gè)細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán),不要分成單個(gè)細(xì)胞。將小滴內(nèi)的所有內(nèi)含物移到制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每天進(jìn)行觀察,2 d后可以見(jiàn)到小的克隆細(xì)胞,即胚胎干細(xì)胞。

    囊胚培養(yǎng)12 h后,用PBS清洗3次,分別用濃度10μg/ml的Hoechst33342和10μg/ml碘化丙啶在37℃染色15 min(注意避光),染色結(jié)束后用PBS清洗2次,封片,在熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。

    1.2.3 胚胎干細(xì)胞過(guò)氧化氫氧化損傷最適濃度的篩選 使用外源性過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激刺激并建立模型,測(cè)出不同濃度的H2O2對(duì)胚胎干細(xì)胞的氧化損傷狀況,以確定建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA對(duì)細(xì)胞消化3 min,PBS清洗3次(速度要快,防止分化),以每孔1×102~5×102個(gè)胚胎干細(xì)胞接種到96孔板,每孔細(xì)胞匯合長(zhǎng)至80%加入200μl胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。分別配制0 μmol/L(對(duì) 照)、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L、150 μmol/L濃度的 H2O2,加入到胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4.5 h后,每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配)20μl繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸出孔內(nèi)上清液。每孔加150 μl DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。使用酶標(biāo)儀(選擇490 nm波長(zhǎng)),測(cè)出OD值。處理組的OD值與對(duì)照組的OD值的比值是增殖率。以細(xì)胞增殖率50% ~60%為建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。

    1.2.4 亞硒酸鈉對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 將最適濃度的H2O2作用于細(xì)胞4.5 h后,再分別向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0μmol/L(對(duì)照)、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和5.5μmol/L不同濃度亞硒酸鈉。用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。

    1.2.5 不同來(lái)源供核細(xì)胞的重構(gòu)胚發(fā)育率的比較 分別用小鼠胚胎干細(xì)胞和胎兒皮膚成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞。超數(shù)排卵3只小白鼠后采用背部取輸卵管,去掉卵丘細(xì)胞后取出帶有第一極體的卵母細(xì)胞,放在細(xì)胞松弛素B的小滴中,采用擠壓法進(jìn)行去核。將供體細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化后,挑選細(xì)胞質(zhì)生長(zhǎng)均勻,質(zhì)量好的細(xì)胞做為供核細(xì)胞。將供核細(xì)胞注入到卵母細(xì)胞的卵黃周隙中,以便融合。使用直流電脈沖融合后用濃度5μmol/L的離子霉素對(duì)重構(gòu)胚進(jìn)行預(yù)激活5 min,之后移入到2 mmol/L的二甲基氨基嘌呤激活4 h。激活之后放入平衡好的培養(yǎng)液小滴中進(jìn)行培養(yǎng),72 h進(jìn)行半量換液,每隔24 h進(jìn)行觀察記錄發(fā)育率。

    1.2.6 亞硒酸鈉處理對(duì)過(guò)氧化氫氧化損傷下胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育率的影響 用最適濃度的H2O2和亞硒酸鈉處理小鼠胚胎干細(xì)胞,培養(yǎng)14 d后細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%可做為供核細(xì)胞,生產(chǎn)重構(gòu)胚,并比較其發(fā)育率。

    1.2.7 奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚的構(gòu)建 以延邊奶山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞做為供核細(xì)胞,來(lái)生產(chǎn)異種重構(gòu)胚,并記錄發(fā)育率。重構(gòu)胚獲取方法同方法1.2.5。

    1.2.8 異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量的檢測(cè) 將胚胎從培養(yǎng)液中取出,用PBS清洗3次,置于濃度為10 μg/ml的DCFH-DA染色液小滴中,避光染色37℃15 min。PBS清洗2次。熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。熒光圖片用Image-6.0軟件進(jìn)行量化分析。

    1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析的方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

    2 結(jié)果

    2.1 胚胎干細(xì)胞的獲得

    囊胚在培養(yǎng)12 h之后,分別用Hoechst 33342和PI在37℃染色可以清晰的看到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(圖1),獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在飼養(yǎng)層上進(jìn)行共培養(yǎng),經(jīng)過(guò)4 d的克隆培養(yǎng)得到大量的胚胎干細(xì)胞。

    2.2 亞硒酸鈉對(duì)胚胎干細(xì)胞抗氧化損傷的影響

    圖1 囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)Fig.1 Inner cellmass of blastocyst

    在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入0μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L和 150 μmol/L濃度的H2O2,以不添加H2O2對(duì)照組細(xì)胞增殖率為100%。結(jié)果顯示:30μmol/L、60μmol/L、90 μmol/L H2O2處理的細(xì)胞增殖率顯著高于 120 μmol/L、150 μmol/L H2O2處理(P<0.05)(圖 2)。當(dāng)H2O2濃度為90μmol/L時(shí),胚胎干細(xì)胞增殖率降低至50% ~60%。因此,90μmol/L H2O2為最適合建立過(guò)氧化氫氧化損傷模型的濃度。

    圖2 不同濃度的過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)胚胎干細(xì)胞的氧化損傷Fig.2 Oxidative damage of embryonic stem cell caused by different concentrations of hydrogen peroxide(H 2O 2)

    90μmol/L H2O2處理胚胎干細(xì)胞4.5 h后,分別向培養(yǎng)基中加入 0μmol/L、1.5μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和 5.5 μmol/L亞硒酸鈉,結(jié)果顯示,3.5μmol/L亞硒酸鈉處理的細(xì)胞增殖率顯著高于其他處理(P<0.05),且 1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、4.5 μmol/L、5.5 μmol/L亞硒酸鈉處理間無(wú)顯著性差異(圖3)。表明亞硒酸鈉對(duì)90μmol/L H2O2氧化應(yīng)激的最佳保護(hù)濃度則為3.5 μmol/L。

    圖3 不同濃度的亞硒酸鈉對(duì)過(guò)氧化氫氧化損傷下胚胎干細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of different concentrations of sodiumselenite on embryonic stem cells oxidated by H2 O2

    2.3 亞硒酸鈉對(duì)不同來(lái)源供核細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

    采用生長(zhǎng)良好的小鼠胚胎干細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞做為供核細(xì)胞,生產(chǎn)重構(gòu)胚,統(tǒng)計(jì)其發(fā)育率(表1和圖4)。數(shù)據(jù)顯示,在培養(yǎng)2 d后胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚的胚胎卵裂率顯著高于成纖維細(xì)胞重構(gòu)胚的胚胎卵裂率(P<0.05),但兩組間的囊胚率差異不顯著。經(jīng)亞硒酸鈉處理的胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚卵裂率顯著高于未處理的卵裂率(P<0.05),兩組間的囊胚率差異也顯著(P<0.05)。

    表1 不同來(lái)源供核細(xì)胞重構(gòu)胚的發(fā)育率Table 1 Developmental efficiency of embryonic stem cells of nuclei from different somatic cells

    圖4 小鼠胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚的產(chǎn)生過(guò)程Fig.4 The process of reconstructed embryos production from embryonic stem cells

    2.4 亞硒酸鈉對(duì)延邊奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚發(fā)育率的影響

    結(jié)果(表2)顯示,延邊奶山羊成纖維細(xì)胞構(gòu)成的異種重構(gòu)胚卵裂率和囊胚率顯著低于小鼠成纖維細(xì)胞構(gòu)成的重構(gòu)胚(P<0.05)。添加亞硒酸鈉濃度為5 ng/ml[11]異種重構(gòu)胚卵裂率顯著高于未添加亞硒酸鈉異種重構(gòu)胚卵裂率(P<0.05),囊胚率差異不顯著。

    表2 延邊奶山羊-鼠異種重構(gòu)胚的發(fā)育率Table 2 Developmental rates of interspecies reconstructed embryo from Yanbian dairy goat and mouse

    2.5 亞硒酸鈉對(duì)異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量的影響

    對(duì)2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、桑椹胚內(nèi)部的ROS含量進(jìn)行檢測(cè),由表3可知,在2-細(xì)胞期,添加亞硒酸鈉的異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量顯著低于未添加亞硒酸鈉處理(P<0.05);4-細(xì)胞和桑椹胚期,添加亞硒酸鈉的異種重構(gòu)胚內(nèi)部ROS含量與未添加亞硒酸鈉的差異均不顯著。

    表3 胚胎內(nèi)部的ROS含量Table 3 Reactive oxygen species(ROS)content inside embryos

    3 討論

    在體外,培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞條件要求較高,分離培養(yǎng)的過(guò)程也比較復(fù)雜,影響環(huán)節(jié)諸多,要做到培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境盡量保持一致。把胚胎從透明帶中孵出是提取胚胎干細(xì)胞的關(guān)鍵,而輔助孵化技術(shù)有助于體外培養(yǎng)的胚胎從透明帶中孵化出。目前,輔助孵化技術(shù)有:機(jī)械法[12]、酶消化法[13-14]、酸化法和激光輔助孵化法[15]。機(jī)械法容易造成囊胚破裂,實(shí)施難度較大。酸化法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高,并且對(duì)細(xì)胞的毒性較大。酶消化法簡(jiǎn)單易行,但是對(duì)胚胎的損傷很大,并且消化后囊胚不容易貼壁。由于胚胎干細(xì)胞是來(lái)自于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并且在移植前有一些代謝特點(diǎn)[16]。比如說(shuō),在體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞自動(dòng)分化過(guò)程可以為檢測(cè)細(xì)胞從厭氧到需氧過(guò)度的動(dòng)態(tài)性變化提供一個(gè)模型。細(xì)胞就能量供應(yīng)來(lái)說(shuō)氧化磷酸化要優(yōu)于糖酵解[17]。細(xì)胞在體外成熟氧氣較多時(shí),厭氧代謝途徑終止。正在分化或者已經(jīng)分化了的細(xì)胞在有氧條件下用于氧化磷酸化的線粒體有所增加[18]。據(jù)之前報(bào)道,ROS水平過(guò)高,會(huì)使機(jī)體抗氧化損傷能力下降,從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。濃度過(guò)低,可致細(xì)胞凋亡[19-20]。在細(xì)胞里產(chǎn)生ROS的來(lái)源有多處,但大部分在線粒體[21]。因此,胚胎干細(xì)胞是檢測(cè)抗氧化性的一個(gè)良好平臺(tái)。本試驗(yàn)首先用外源性H2O2對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷,之后采用亞硒酸鈉對(duì)胚胎干細(xì)胞的氧化損傷進(jìn)行保護(hù),測(cè)出細(xì)胞增殖率進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,當(dāng)H2O2濃度為90.0μmol/L時(shí),細(xì)胞增殖率較小,對(duì)胚胎干細(xì)胞氧化損傷較大,為適宜濃度。亞硒酸鈉對(duì)這種氧化應(yīng)激的最佳保護(hù)濃度為3.5μmol/L。

    異種重構(gòu)胚技術(shù),是通過(guò)使用分布比較普遍動(dòng)物的卵母細(xì)胞對(duì)瀕臨滅絕動(dòng)物進(jìn)行重構(gòu)胚,使稀有動(dòng)物得到延續(xù)的一種方法之一。另外還可通過(guò)誘導(dǎo)異種重構(gòu)胚干細(xì)胞分化成卵母細(xì)胞的方法。異種重構(gòu)胚難點(diǎn)在于2個(gè)物種的遺傳距離和物種差異可能導(dǎo)致基因組轉(zhuǎn)錄和翻譯的失敗。優(yōu)化異種重構(gòu)胚的培養(yǎng)體系是提高重構(gòu)胚發(fā)育率的方法之一,異種移植有著特定的重構(gòu)胚體系,從而來(lái)適應(yīng)供體核的移植,核重塑及重編程。供體核的選擇、融合激活策略的不同、培養(yǎng)體系的改變會(huì)對(duì)異種重構(gòu)胚的發(fā)育也有著有很大的影響。供體核代數(shù)的不同有著特異的表達(dá)狀態(tài)[22]和 mRNA 表達(dá)模式[23]可能是重編程較差的原因。試驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠胚胎干細(xì)胞做為供核細(xì)胞得到的重構(gòu)胚要顯著高于同種的體細(xì)胞移植[24]。有研究表明,用人類神經(jīng)干細(xì)胞做為供核細(xì)胞與山羊卵母細(xì)胞獲得了異種重構(gòu)胚[25]。細(xì)胞成熟促進(jìn)因子是促使核膜破裂、染色體凝集,但是細(xì)胞成熟促進(jìn)因子再激活后會(huì)迅速下降到常規(guī)水平。有專家采用卵母細(xì)胞預(yù)先激活[26]和延遲激活[27]的方法提高重構(gòu)胚發(fā)育率。還有研究稱,采用不同培養(yǎng)液(mSOF和 TCM-199)處理喜馬拉雅斑羚-牛的異種重構(gòu)胚培養(yǎng),結(jié)果mSOF培養(yǎng)液能夠得到囊胚,而TCM-199沒(méi)有獲得囊胚[28]。本試驗(yàn)中,亞硒酸鈉處理的小鼠胚胎干細(xì)胞重構(gòu)胚和延邊奶山羊-鼠胎兒皮膚成纖維細(xì)胞異種重構(gòu)胚的卵裂率顯著高于未經(jīng)亞硒酸鈉處理的胚胎干細(xì)胞。

    [1] ARUFEM C ,LUM,KUBO A,et al.Directed differentiation of mouse embryonic stem cells into thyroid follicular cells[J].Endocrinology,2006,147(6):3007-3015.

    [2] SALDEEN J,KRIZ V,AGREN N.et al.SHB and angiogenic factors promote ES cell differentiation to insulin-producin cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,344(2):517-524.

    [3] 張秀華,趙云程,林嘉鵬,等.bFGF培養(yǎng)體系中添加不同因子對(duì)綿羊類胚胎干細(xì)胞多能性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,28(4):797-803.

    [4] EZASHIT,DASP,ROBERTSR M,et al.Low O2tensions and the prevention of differentiation of hES cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:4783-4788.

    [5] BROWNGC.Control of respiration and ATP synthesis inmammalian mitochondria and cells,Biochem[J].1992,284:1-13.

    [6] OH SK,KIM H S,AHN H J,et al.Derivation and characterization of new human embryonic stem cell lines:SNUhES1,SNU-hES2,and SNUhES3[J].Stem Cells,2005,23:211-219.

    [7] STJOHN JC,RAMALHO-SANTOSJ,GRAY H L,et al.The expression of mitochondrial DNA transcription factors during early cardiomyocytein vitrodifferentiation from human embryonic stem cells[J].Cloning Stem Cells,2005,7:141-153.

    [8] GUTTERMAN D D.Mitochondria and reactive oxygen species:an evolution in function[J].Circ Res,2005,97:302-304.

    [9] OLSON S E,SEIDEL G E.Culture ofin vitro-produced bovine embryoswith vitamin E improves developmentin vitroand after transfer to recipients[J].Biol Reprod,2000,62:248-252.

    [10] THOMPSON JG,SIMPSON A C,PUGH PA,et al.Effect of oxygen concentration onin vitrodevelopment of preimplantation sheep and cattle embryos[J].J Reprod Fertil,1990,89:573-578.

    [11]尹 多,朱玉霞,柳海星,等.自由基吸收類抗氧化劑對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞克隆重構(gòu)胚發(fā)育的影響[J].2012,43(8):1215-1221.

    [12] 張愛(ài)軍,馮 云,夏 蘭,等.不同機(jī)械輔助孵化方式對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育影響的研究[J].生殖與避孕,2005,25(11):675-678.

    [13] 徐小明,竇忠英,華進(jìn)聯(lián),等.免疫外科法分離克隆BALB/c小鼠胚胎干細(xì)胞[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2004,12(3):129-133.

    [14] 彭紅梅,陳貴安.單細(xì)胞克隆小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立[J].北京大學(xué)報(bào),2004,36(4):431-434.

    [15] TANAKA N,TAKEUCHI T,NERIQ V,et al.Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system:application sand preliminary results in amurinemodel[J].JTransl Med,2006,4:20.

    [16] SATHANANTHAN H,PERA M,TROUNSON A,et al.The fine structure of human embryonic stem cells[J].Reprod Biomed,2002,4:56-61.

    [17] BROWNGC.Control of respiration and ATPsynthesis inmammalian mitochondria and cells[J].Biochem J,1992,284(1):1-13.

    [18] YOUNG M C.Dynamic changes in mitochondrial biogenesis and antioxidant enzymes during the spontaneous differentiation of human embryonic stem cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,348:1472-1478.

    [19] JOZA N,SUSIN SA,DAUGASE,et al.Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor programmed cell death[J].Nature,2001,410:549-554.

    [20] SUSIN S A,LORENZO H K,ZAMZAMI N,et al.Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor[J].Nature,1999,397:441-446.

    [21] LIX Y.Targeting mitochondrial reactive oxygen species as novel therapy for inflammatory diseases and cancers[J].Journal of Hematology & Oncology,2013,6:19.

    [22] ENRIGHT B P,JEONG B S,YANG X,et al.Epigenetic characteristics of bovine donor cells for nuclear transfer:Levels of histone acetylation[J].Biol Reprod,2003,69(5):1525-1530.

    [23] WRENZYCKI C,WELLS D,HERRMANN D,et al.Nuclear transfer protocol affects messenger RNA expression patterns in cloned bovine blastocysts[J].Biol Reprod,65(1):309-317.

    [24] WAKAYAMA T,RODRIGUEZ I,PERRY A C F,et al.Mice cloned from embryonic stem cell[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(26):14984-14989.

    [25] SHA H Y,CHEN JQ,CHEN J,et al.Fates of donor and recipient mitochondrial DNA during generation of interspecies SCNT-derived human ES-like cells[J].Cloning and Stem Cells,2009,11(4):497-507.

    [26] MITALIPOV SM,ZHOU Q,BYRNEET JA,et al.Reprogramming following somatic cell nuclear transfer in primates is dependent upon nuclear remodeling[J].Human Reproduction,2007,22(8):2232-2242.

    [27] LEE B C,KIM M K,JANG G,et al.Dogs cloned from adult somatic cells[J].Nature,2005,436(51):641.

    [28] OH B C,KIM JT,SHIN N S,et al.Production of blastocysts after intergeneric nuclear transfer of goral(Naemorhedus goral)somatic cells into bovine oocytes[J].JV et Med Sci,2006,68(11):1167-1171.

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