農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)擬南芥AtCHX23基因玉米及其耐鹽性

岳潤清， 鐵雙貴， 韓小花， 齊建雙， 燕樹鋒， 林 鴻， 徐玉隔， 劉 芳

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，河南省玉米生物學重點實驗室，河南 鄭州 450002;2.鄭州大學生物工程系，河南鄭州 450001;3.河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

土壤鹽漬化是嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的因素之一，全球約20%的耕地和將近一半的灌溉土地遭受鹽漬化影響［1］。中國現(xiàn)有鹽堿地9.913×108hm2，每年因鹽堿地造成的農(nóng)業(yè)直接損失達數(shù)百億元［2］。玉米是中國第二大作物，可以用作糧食、飼料和工業(yè)原料等，是中國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的支柱。然而，玉米對鹽分中度敏感，耐鹽性相對較差，這極大地限制了其種植面積的擴大。由于缺乏耐鹽玉米種質(zhì)，嚴重限制了玉米耐鹽性的遺傳研究和耐鹽玉米新品種的選育。

基因工程的迅速發(fā)展與完善，為人類進一步提高作物的抗逆性提供了新的策略和強有力工具［3-4］。而利用基因工程遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對作物進行改良，培育耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米新品種已經(jīng)成為在鹽堿地上種植玉米的有效途徑之一［5］。國內(nèi)外學者克隆了一些和耐鹽相關(guān)的基因，并進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了一些耐鹽性較高的轉(zhuǎn)基因玉米新材料。Zhang等［6］和 Li等［7］將TsCBF1基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，顯著提高了玉米抗旱或耐鹽能力。Chen等［8］將OsNHX1基因成功轉(zhuǎn)入玉米中，轉(zhuǎn)基因玉米耐鹽性得到提高。楊愛芳等［9］將來自大腸桿菌膽堿脫氫酶基因betA轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系中，批量獲得了轉(zhuǎn)基因植株，從其后代中選育出耐鹽性大幅度提高的抗除草劑自交系。任小燕等［10］采用超聲波輔助花粉介導法將山菠菜膽堿單加氧酶AhCMO基因轉(zhuǎn)入玉米中，獲得耐鹽性提高的玉米新材料。王奕等［11］把耐鹽基因DREB2A轉(zhuǎn)入玉米自交系H99以及雜交種H99xA188，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。這些研究結(jié)果表明采用基因工程技術(shù)培育玉米耐鹽品種是可行的。轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過種屬間基因的流動彌補了玉米遺傳資源的不足，與常規(guī)育種結(jié)合必將帶來育種上的重大突破，它是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的核心領(lǐng)域，并將成為作物育種的一種重要手段。

擬南芥CHX23基因是Song等［12］從擬南芥中克隆出的一個在植物抗鹽脅迫反應中起重要作用的基因，將其轉(zhuǎn)入煙草中后獲得了耐鹽轉(zhuǎn)基因煙草植株。本研究通過PCR方法試圖克隆擬南芥AtCHX23基因，構(gòu)建植物組成型高效表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導法將其轉(zhuǎn)到玉米自交系鄭58中，對轉(zhuǎn)基因玉米耐鹽性進行初步研究，為培育轉(zhuǎn)基因耐鹽玉米提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型，為河南省玉米生物學重點實驗室保存。玉米轉(zhuǎn)基因受體鄭58為河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所提供，開花后12～14 d的玉米幼胚用于遺傳轉(zhuǎn)化。

各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自 TaKaRa公司。農(nóng)桿菌GV3101和DH5a由河南省玉米生物學重點實驗室保存;植物表達載體pGreen-0229為河南大學提供。DIG high primer DNA labeling and detection starter kit I為Roche產(chǎn)品;其他藥品、試劑均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1AtCHX23基因的克隆與植物表達載體的構(gòu)建 從擬南芥基因組中克隆AtCHX23基因(上游引物:5'-ATACTCGAGATGTCTTCCGGAGCCCCC-3';下游引物:5'-TGTAAGCTTTTACCTATGAATTCCATATTGATGAT-3')，構(gòu)建到植物表達載 pGreen-0229載體上，16℃ 過夜連接，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGreen-0229-AtCHX23轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，對獲得的重組質(zhì)粒進行酶切，PCR鑒定。其中35S組成型高表達啟動子控制AtCHX23基因的表達，Bar基因標記基因為篩選標記。

1.2.2 玉米的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的分子鑒定玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化參照劉允軍［13］的方法，通過凍融法將表達載體導入農(nóng)桿菌GV3101。在篩選培養(yǎng)基上添加雙丙胺膦篩選抗性苗，將獲得的抗性苗進行煉苗移栽。植物DNA提取按照改良后Saghai-Maroof等［14］提出的CTAB方法進行，以轉(zhuǎn)基因和野生型植株玉米葉片的全基因組DNA為模板，根據(jù)AtCHX23序列特異引物(上游引物:5'-CTACTATCTAACCCGACCCTTG-3';下游引物:5'-AAAGAAGCAAACCCAAAAAC-3')檢測轉(zhuǎn)基因株系。將通過PCR篩選出的其中2個陽性轉(zhuǎn)基因株系進行Southern blot試驗鑒定。玉米基因組DNA經(jīng)BamH I酶切后，電泳轉(zhuǎn)膜，利用標記試劑盒(Primer-a-gene Labeling System Promega，USA)和 α-32P-dCTP(上海生工生物工程有限公司)進行標記［15］，整個試驗過程在浙江大學植物生理與生化重點實驗室完成。

轉(zhuǎn)基因植株的RNA提取以及RT-PCR檢測:取0.1 g新鮮玉米葉片，液氮充分研磨后，用Trizol(Invitrogen，USA)提取葉片總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物(北京天根生化科技有限公司)，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，USA)進行cDNA的合成后，按照上述基因組DNA的PCR檢測方法進行擴增。

1.2.3 鹽脅迫處理及玉米幼苗生理指標的測定 選取健康、大小、飽滿度一致的鄭58非轉(zhuǎn)基因玉米種子，用10 g/L次氯酸鈉溶液消毒20 min，清水洗凈后于室溫下清水浸種6 h，然后將其置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中發(fā)芽，其間及時補充清水保持濕度。3 d后，挑選芽期生長狀況良、長勢一致、且PCR檢測陽的幼苗，轉(zhuǎn)移至150 mmol/L NaCl的Hoagland營養(yǎng)液中進行鹽脅迫處理［10］，每天按此濃度澆灌。7 d后，取玉米葉片進行檢測。葉片可溶性糖(WSS)含量的測定采用蒽酮法;游離脯氨酸(Pro)含量的測定采用磺基水楊酸法;丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法［16］。每個分析樣本取10株進行測定，重復3次，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 AtCHX23基因的克隆和載體構(gòu)建

根據(jù)AtCHX23基因DNA序列設(shè)計引物，采用PCR方法從擬南芥基因組擴增2.6 kp DNA片段，連接到T載體，經(jīng)測序和Blast驗證，擴增片段確實為AtCHX23基因序列，采用XhoI和XbaI分別對TAtCHX23和 pGreen0229載體進行雙酶切，過夜連接。得到植物表達載體pGreen0229-35S-AtCHX23。測序結(jié)果顯示，AtCHX23基因正確插入CaMV35S啟動子和終止子之間。

2.2 轉(zhuǎn)AtCHX23基因玉米植株的獲得

取授粉后10～14 d的玉米穗進行剝胚，以大小為1.0～2.0 mm的幼胚作為外植體，通過農(nóng)桿菌介導法將AtCHX23基因?qū)雰?yōu)良自交系鄭58中，經(jīng)過雙丙胺膦(Bar基因3.0 mg/L)的篩選、愈傷組織分化、再生苗的生根和壯苗培養(yǎng)(圖1)，共獲得56株具有雙丙胺膦抗性的T0代玉米再生植株。

圖1 玉米轉(zhuǎn)基因植株的再生Fig.1 Regeneration of transgenic maize plants

為了檢測再生玉米基因組中是否有AtCHX23基因的插入，以AtCHX23基因特異引物進行PCR擴增檢測，陽性植株擴增出與質(zhì)粒相同大小的片段，而受體對照植株未擴增出相應片段，可以初步證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中(圖2)。從圖2我們可以也看出PCR共檢測得到26株陽性植株，抗性植株陽性率為44.8%。3次重復結(jié)果一致。26株陽性植株是從6個不同的抗性愈傷組織塊得到的，因此我們可以初步認為有6個獨立的T0代陽性轉(zhuǎn)基因株系，選取其中2個長勢比較好株系，命名為Ov1和Ov3，用于下一步分子檢測和抗性鑒定試驗。

圖2 T0代轉(zhuǎn)基因抗性植株的PCR檢測Fig.2 PCR analysis of T0 transgenic maize plants

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子檢測

為了進一步確定外源基因的整合情況，對PCR陽性株系Ov1和Ov3植株進行Southern blot分析，提取葉片基因組DNA用BamH I酶切后，以Bar基因片段為探針進行雜交，雜交結(jié)果顯示，這2個PCR陽性株系可以檢測到雜交條帶(圖3A)，仍表現(xiàn)為陽性，并且每個株系雜交條帶只有一條，位置不同，而野生型(WT)中沒有檢測到雜交信號，表明Ov1和Ov3為2個獨立的陽性轉(zhuǎn)基因株系，在這2個株系中AtCHX23基因以單拷貝形式成功整合到玉米基因組。

提取Ov1和Ov3株系葉片的總RNA，利用RTPCR方法分析轉(zhuǎn)基因株系中外源基因AtCHX23的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，以這2個轉(zhuǎn)化植株的cDNA為模版，以AtCHX23基因的特異引物進行PCR擴增均有陽性條帶出現(xiàn)，并且這2個轉(zhuǎn)基因玉米株系中AtCHX23基因的表達水平比較高，而對照株系沒有擴增出相應條帶，表明在這2個陽性株系中外源基因AtCHX23過量表達(圖3B)。

圖3 2個玉米轉(zhuǎn)基因株系的Southern blot(A)和RT-PCR(B)分析Fig.3 Analysis of two transgenicmaize lines by Southern blot(A)and RT-PCR(B)

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米的耐鹽性分析

取轉(zhuǎn)AtCHX23基因的Ov1和Ov3 2個株系的T3代植株進行耐鹽性分析，首先對其芽苗進行PCR檢測，轉(zhuǎn)基因苗全部為陽性，說明T3代轉(zhuǎn)基因株系已經(jīng)純合，部分PCR檢測結(jié)果如圖4A。鹽脅迫處理3 d后，轉(zhuǎn)基因玉米株系和對照株系的生長差異較小;但隨著鹽脅迫處理時間的增長，處理7 d后，Ov1和Ov3這2個轉(zhuǎn)基因玉米株系已明顯優(yōu)于野生型玉米(圖4B)。野生型植株大部分葉子卷曲、葉尖變黃，嚴重的植株全部變黃卷曲死亡;鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株也受到一定影響，部分葉尖出現(xiàn)卷曲變黃，但2個轉(zhuǎn)基因株系Ov1和Ov3長勢優(yōu)于野生型。另外，在無鹽脅迫的狀態(tài)下，轉(zhuǎn)AtCHX23基因的2個株系Ov1、Ov3和野生型植株之間沒有明顯的生長差異(圖4C)。由此可見，AtCHX23基因的轉(zhuǎn)入能夠提高玉米苗期的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因玉米生理生化指標的變化

為了驗證AtCHX23基因的過量表達是否影響玉米中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量，對處理10 d野生型和2個轉(zhuǎn)基因株系(Ov1和Ov3)地上部可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量進行檢測。非鹽脅迫條件下，野生型和2個轉(zhuǎn)基因株系中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛的含量基本無顯著差異，但在150 mmol/L NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因玉米株系和野生型的可溶性糖和脯氨酸含量都有增長趨勢，其中2個轉(zhuǎn)基因株系中可溶性糖含量分別達到46.9μg/g和44.5μg/g，分別是野生型的1.26和1.28倍，提高了27.9%和26.1%;2個轉(zhuǎn)基因株系中脯氨酸含量與野生型相比，分別提高了33.5%和34.6%(圖5);但2個轉(zhuǎn)基因株系中丙二醛含量低于野生型，野生型株系丙二醛含量為12.66μmol/g，Ov1和Ov3 2個轉(zhuǎn)基因株系丙二醛含量分別為7.90μmol/g和8.38 μmol/g，2個轉(zhuǎn)基因株系中丙二醛含量比野生型分別減少了37.6%和33.8%(圖5)。

3 討論

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米和野生型幼苗在NaCl處理7 d后的植株表現(xiàn)特征Fig.4 Phenotypes of transgenic and wild-typemaize seed lings under NaCl treatment for seven days

圖5 野生型和轉(zhuǎn)基因株系在0和150 mmol/L NaCl處理下可溶性糖、脯氨酸和丙二醛的含量Fig.5 Soluble sugar，protein and methane dicarboxylic aldehyde contents of maize seedlings of wild type and two transgenic lines under 0 and 150 mmol/L NaCl treatments

近年來，用于轉(zhuǎn)基因玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法很多:有超聲波處理花粉介導法［10］、基因槍法［17-18］和農(nóng)桿菌介導方法［19-21］等。農(nóng)桿菌作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有能轉(zhuǎn)移較大的DNA片段、整合的外源基因重排少且多以單或寡拷貝整合并能穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點，在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中應用最多。孫傳波等［22-23］通過農(nóng)桿菌介導法將耐鹽基因HAL1轉(zhuǎn)入到玉米自交系H99中，獲得再生植株。Zhang等［6］采用農(nóng)桿菌介導法將TsCBF1基因?qū)胗衩字?，并且在其后代中表達。Assem［24］將NPK1基因與Bar基因結(jié)合后用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化到玉米自交系中。Wang［25］利用農(nóng)桿菌介導法在轉(zhuǎn)基因玉米中進行ZmPLC1基因正、反方向表達，并由Southern雜交證實ZmPLC1基因已整合到玉米基因組中。這些研究說明應用農(nóng)桿菌介導方法轉(zhuǎn)化外源DNA可以得到玉米抗旱新資源，是一種可行、有效的抗旱育種方法。我們通過河南省玉米生物學重點實驗室建立并優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導的方法將擬南芥AtCHX23基因?qū)豚崋?58的優(yōu)良親本自交系材料鄭58中，經(jīng)過共培養(yǎng)、恢復培養(yǎng)和3次除草劑篩選后，共獲得轉(zhuǎn)化植株56株，通過PCR初步鑒定，其中26株呈陽性，抗性植株陽性率為44.8%;通過對轉(zhuǎn)基因株系進行分子鑒定、轉(zhuǎn)錄表達分析及 Southern blot鑒定，獲得了以單拷貝的形式成功插入到玉米基因組中且AtCHX23基因過量表達的2個玉米株系，證明外源基因AtCHX23已經(jīng)整合到鄭單958的優(yōu)良親本自交系材料鄭58中。這些研究結(jié)果表明利用基因工程向栽培植物導入外源目的基因，已發(fā)展成為改良玉米耐鹽性的新途徑。

關(guān)于AtCHX23耐鹽性研究，在擬南芥和煙草方面已經(jīng)得到證明，超表達AtCHX23的擬南芥和煙草植物，抗鹽性均比對照提高20%［12］。本試驗結(jié)果表明過量表達AtCHX23基因能提高轉(zhuǎn)基因玉米的耐鹽性。前人研究結(jié)果表明當NaCl濃度為150 mmol/L時，鄭58幼苗植株能表現(xiàn)出受害癥狀［10］。因此本試驗選擇150 mmol/L作為玉米苗期耐鹽處理濃度。在本研究中，正常情況下，轉(zhuǎn)基因株系和野生型間生長無明顯差異，但在鹽脅迫下，玉米幼苗受到一定的影響，包括轉(zhuǎn)基因植株，部分葉尖出現(xiàn)卷曲變黃，但與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系生長優(yōu)勢明顯。由此可見，AtCHX23基因的轉(zhuǎn)入能夠提高轉(zhuǎn)基因玉米的耐鹽性。

研究結(jié)果表明:玉米幼苗在鹽脅迫下，無論生長發(fā)育狀況和生理生化指標都受到很大影響［26］。本試驗在正常情況下，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因株系中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛的含量無顯著差異;鹽脅迫下，2個轉(zhuǎn)基因玉米株系的可溶性糖、脯氨酸含量高于非轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)耐鹽基因玉米株系Ov1和Ov3的可溶性糖含量為野生型的1.26和1.28倍，而相應地2個轉(zhuǎn)基因株系脯氨酸含量為野生型的1.33倍和1.35倍;轉(zhuǎn)基因玉米株系可溶性糖、脯氨酸含量的提高可能因為AtCHX23基因的過量表達可以起到穩(wěn)定細胞膜和原生質(zhì)作用所致［27］，是轉(zhuǎn)基因玉米適應鹽脅迫下的一種生理調(diào)控防御反應機制，這與Lutts等［28］的研究結(jié)果是相對應的;與可溶性糖、脯氨酸含量變化不同的是:轉(zhuǎn)基因玉米株系Ov1和Ov3地上部丙二醛含量均低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨湓蚩赡苁怯捎贏tCHX23基因的大量表達降低了轉(zhuǎn)基因植物在鹽脅迫下膜脂的抗氧化能力，提高了植物組織的保護能力。本試驗證明過量表達AtCHX23基因能提高轉(zhuǎn)基因玉米苗期的耐鹽性，而關(guān)于AtCHX23基因在玉米鹽脅迫中的表達調(diào)控功能有待進一步研究。

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