慢性HBV感染患者特異性細(xì)胞免疫功能與病毒載量的關(guān)系研究＊

韓海霞，吳玉蘭，陳 琳，吳月平，邵建國(guó)（江蘇省南通市第三人民醫(yī)院 226006）

乙型肝炎由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致。目前全球約有3億HBV感染患者，中國(guó)則為HBV感染高流行地區(qū)［1－2］。HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在病毒清除和肝細(xì)胞損傷過程中具有重要作用。因此，研究特異性CTL數(shù)量和功能的變化，有利于了解乙型肝炎患者體內(nèi)特異性細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，闡明慢性乙型肝炎患者病情加重的免疫學(xué)機(jī)制，還能為抗病毒治療提供用藥依據(jù)［3］。本研究采用人類白細(xì)胞抗原A2（HLA－A2）限制的 HBVcore18－27抗原表位肽五聚體（Pro5MHC）法，分析了慢性HBV感染患者特異性細(xì)胞免疫功能與病毒載量之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2011年9月至2012年12月本院感染性疾病科收治的乙型肝炎患者94例納入患者組，其中男67例，女27例；年齡34～62歲，平均47.5歲；包括慢性乙型肝炎51例（A組）、乙型肝炎肝硬化43例（B組）。所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》制訂的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他類型肝炎病毒感染、酒精性肝炎、免疫性疾病，3個(gè)月內(nèi)未接受過免疫調(diào)節(jié)劑及抗病毒治療。另選擇于本院體檢健康者40例納入健康對(duì)照組（C組），其中男24例，女16例；年齡32～55歲，平均39.5歲；均排除肝臟及免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集所有受試者晨起空腹肘靜脈血至少4 mL，2mL置于普通試管中，分離血清標(biāo)本用于HBV DNA檢測(cè)；2mL置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.2 HLA－A2基因等位型檢測(cè) 取全血100μL，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人HLA－A2單克隆抗體（美國(guó)BD公司）10μL，室溫條件下避光孵育30min，溶血處理后采用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次；加入500μL PBS，采用XL流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）計(jì)數(shù) HLA－A2陽性細(xì)胞。

1.2.3 HBV抗原特異性CTL檢測(cè) Pro5MHC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Proimmune公司，單克隆抗體針對(duì)的HBV抗原表位肽為 HBVcore18－27，序列為FLPSDFFPSV。FITC標(biāo)記的CD8單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。取全血100μL，加入CD8單克隆抗體和五聚體單克隆抗體各10μL，室溫條件下避光孵育30min，溶血處理后采用PBS洗滌2次；加入500μL PBS，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD8和Pro5MHC檢測(cè)，CD8和Pro5MHC雙陽性細(xì)胞為HBV特異性CTL，計(jì)算HBV特異性CTL在CD8＋細(xì)胞中所占百分比（Pro5MHC／CD8＋）。

1.2.4 HBV DNA檢測(cè) 采用7500型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)儀（美國(guó)ABI公司）檢測(cè)血清HBV DNA水平，檢測(cè)下限為1 000 copies／mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各研究組 HLA－A2陽性率比較 A、B、C組 HLA－A2陽性率分別為50.98%（26／51）、72.09%（31／43）、30.00%（12／40）。B組 HLA－A2陽性率明顯高于 A、C組（P＜0.05），A組HLA－A2陽性率明顯高于C組（P＜0.05）。

2.2 不同HBV DNA水平HBV感染患者CTL水平比較在94例乙型肝炎患者中，共檢出HLA－A2陽性患者57例，按HBV DNA水平將其分為小于103copies／mL組、103～105copies／mL組、大于105copies／mL組，比較各組間HBV特異性CTL水平的差異，結(jié)果顯示，隨著HBV DNA水平升高，HBV特異性CTL水平逐漸減低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組間CD8＋細(xì)胞水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HBV DNA 水 平 大 于 105copies／mL 組 Pro5MHC／CD8＋水平明顯低于其他兩組（P＜0.05），103～105copies／mL組與小于103copies／mL組Pro5MHC／CD8＋水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同HBV DNA水平HBV感染患者CTL水平比較

3 討 論

機(jī)體免疫功能低下是HBV感染及大量復(fù)制的主要因素之一。有研究顯示，在HBV DNA水平較高時(shí)進(jìn)行抗病毒治療，才可有效實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)［5］。HBV感染患者體內(nèi) HBV特異性CTL在清除病毒方面發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，急性HBV感染患者可針對(duì)不同HBV抗原肽產(chǎn)生高表達(dá)的特異性CTL，而慢性HBV感染患者特異性CTL表達(dá)水平較低［6］。

采用HLA－A2限制的HBVcore18－27抗原表位肽五聚體法檢測(cè)HBV特異性CTL，能真實(shí)、準(zhǔn)確地反映CTL的實(shí)際水平［7］。與特異性CTL應(yīng)答密切相關(guān)的主要是HLA－A2。本研究結(jié)果顯示，乙型肝炎肝硬化患者HLA－A2陽性率明顯升高，說明HLA－A2陽性的慢性乙型肝炎患者更易進(jìn)展至肝硬化。在HBV DNA水平較低的患者體內(nèi)，HLA－A2限制的Pro5MHC陽性HBV特異性CTL表達(dá)水平明顯升高，說明HBV特異性CTL在HBV感染患者體內(nèi)能夠直接參與病毒的清除。這與本院研究者之前的研究報(bào)道相符，即CTL應(yīng)答水平隨炎性反應(yīng)程度的增高而增強(qiáng)，炎性反應(yīng)程度越高，細(xì)胞毒性反應(yīng)越明顯，更有利于病毒的清除［8］。

本研究對(duì)不同HBV DNA水平的HBV感染患者CTL水平進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，隨著HBV DNA水平的升高，HBV特異性CTL水平明顯降低（P＜0.05），但CD8＋細(xì)胞水平無明顯變化（P＞0.05）；HBV DNA水平大于105copies／mL的患者，Pro5MHC／CD8＋明顯低于 HBV DNA為103～105copies／mL的患者以及HBV DNA小于103copies／mL的患者（P＜0.05），但 HBV DNA 為103～105copies／mL的患者與 HBV DNA小于103copies／mL的患者之間，Pro5MHC／CD8＋比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見，HBV感染患者體內(nèi)HBV特異性CTL水平隨著病毒復(fù)制活躍程度的增加而減，Pro5MHC／CD8＋則可作為判斷病毒復(fù)制活躍程度的客觀指標(biāo)。HBV DNA水平越低的患者，其體內(nèi)HBV特異性CTL水平越高，可能是由于CTL通過分泌干擾素－1（INF－1）產(chǎn)生抗病毒作用，從而減輕肝細(xì)胞的損傷程度。此外，有流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，HBV DNA水平異常升高的患者，進(jìn)展至肝硬化、肝癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加［9］。

綜上所述，對(duì)慢性HBV感染患者進(jìn)行特異性CTL檢測(cè)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得推廣。本研究為慢性HBV感染患者的免疫治療提供了依據(jù)，也為深入研究HBV感染導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的免疫學(xué)機(jī)制提供了新的思路。

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