3株厭氧產(chǎn)電菌的分離與特性

鄒然，朱葛夫，張凈瑞，劉紫璇，劉超翔，黃栩

（1中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，福建 廈門 316021；2蘭州理工大學(xué)土木工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

對微生物燃料電池（MFC）的研究發(fā)現(xiàn)，外加一定電壓可使體系在降解污染物的同時產(chǎn)生氫氣，Logan等[1-2]于2005年首次把這種新的產(chǎn)氫技術(shù)稱為微生物電解池（MEC）。目前對MEC的研究主要以MFC已有的研究成果為基礎(chǔ)，重點集中在以下4個方面：反應(yīng)器的設(shè)計[3-4]，底物的選擇[5-6]，電極材料的優(yōu)化[7-8]，微生物的研究[9-10]。產(chǎn)電菌作為MEC的重要微生物，在降解有機(jī)物和轉(zhuǎn)移電子方面發(fā)揮重要作用。但目前，大部分產(chǎn)電菌是從 MFC中分離出來后應(yīng)用于MEC中，直接從MEC中分離出來的產(chǎn)電菌較少[11-12]。而已經(jīng)從MFC中分離出的產(chǎn)電菌種類主要有地桿菌 （Geobacteracae）[13]、 希瓦氏菌 （Shewanella）[14]、 假單孢菌（Pseudomonas）[15]、梭菌（Clostridium）[16]、脫硫單菌（Desulfuromonas）[17]和鐵還原紅育菌 （Rhodofoferax ferrireducens）[18]等。其中以地桿菌、希瓦氏菌和假單孢菌屬的研究居多，而其他種類的產(chǎn)電菌少見報道。

厭氧“發(fā)酵障礙”是厭氧代謝中的一大難題?！鞍l(fā)酵障礙”是指在厭氧代謝過程中，中間產(chǎn)物揮發(fā)酸的積累抑制發(fā)酵菌群對有機(jī)物進(jìn)一步的降解，從而降低微生物對碳源的利用率，影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性[19-20]。而產(chǎn)電菌群能夠以多種厭氧代謝中間產(chǎn)物作為底物生長，若將產(chǎn)電菌群引入?yún)捬醮x體系中，實現(xiàn)產(chǎn)酸發(fā)酵菌群和產(chǎn)電菌群對有機(jī)物梯級利用，則能夠為厭氧代謝提供一種新途徑。而實現(xiàn)產(chǎn)酸菌和產(chǎn)電菌生態(tài)位的耦合則是達(dá)到這一目的的關(guān)鍵，因此，篩選分離出能以多種揮發(fā)酸為底物、耐酸能力較強(qiáng)、具有較強(qiáng)電化學(xué)活性產(chǎn)電菌的研究工作顯得尤為重要。

本研究中以 MEC電極生物膜作為產(chǎn)電菌分離的菌源，采用Hungate厭氧菌培養(yǎng)技術(shù)成功分離出3株產(chǎn)電菌，通過考察其生理生化特征探討了其應(yīng)用于解決厭氧“發(fā)酵障礙”的可行性。同時，測定了菌株產(chǎn)電活性，為探討其在 MFC中的應(yīng)用潛力和范圍提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種的分離和純化

1.1.1 菌種來源

用于分離產(chǎn)電菌的微生物樣品取自本實驗室運行的一個單室MEC。該MEC是以乙酸鈉為底物，以產(chǎn)氫氣為主要目的。樣品采集時，MEC已穩(wěn)定運行 90天，其期間的氫氣產(chǎn)率為(2.8±0.1) mLH2/(mgCOD)，能量效率值為138.6±3.1%。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基的組成：胰蛋白胨4.0 g/ L、牛肉浸膏4.0 g/ L、酵母1.0 g/ L、CaCl20.2 g/ L 、NaCl 5.0 g/ L、乙酸鈉16.0 g/ L、FeSO4.7H2O 0.2 g/ L、MgCl20.2 g/ L、K2HPO41.2 g/ L、半胱氨酸1.0 g/ L、檸檬酸鐵5.0 mmol/L、M液和V液各5.0 mL/L[21]、1 g/L的刃天青0.4 mL/L，調(diào)節(jié)pH值為7。

固體培養(yǎng)基的組成：在液體培養(yǎng)基的組成成分之外再加入15～20 g/L的瓊脂粉。

1.1.3 分離操作方法

在厭氧無菌條件下，從 MEC電極膜上裁剪一小片（2.0 mm×2.0 mm），投入含已滅菌的液體培養(yǎng)基的厭氧瓶中，密封后置于37 ℃條件下富集培養(yǎng)5天。將富集后的液體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，選擇10?4、10?5、10?6、10?74 個稀釋度的菌懸液接入固體培養(yǎng)基中，冷水浴中滾管后，垂直放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng) 1～2 周。選擇大小適中、相距較遠(yuǎn)的菌落，用接種針在無菌厭氧環(huán)境中將其接種于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)5天。重復(fù)上述滾管分離和擴(kuò)大培養(yǎng)操作4次，至滾管中固體培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)相對一致。

1.2 16S rDNA基因擴(kuò)增與測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對分離得到的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，吸取部分菌液離心并收集的菌體。采用美國OMEGA公司的土壤DNA試劑盒提取DNA。PCR擴(kuò)增引物為：27F （ 5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3.00 min、94 ℃變性l.00 min、54 ℃退火0.75 s、72 ℃延伸1.50 min、30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5.00 min。PCR產(chǎn)物分別通過瓊脂糖電泳和Nanodrop （Thermo Fisher Scientific）定性和定量。經(jīng)切膠純化的PCR產(chǎn)物交由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成測序。將菌株的16S rDNA測序結(jié)果提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，使用DNAMAN將其與同源性較高的產(chǎn)電菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對，采用最大似然法繪出系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗（1000次）。根據(jù)測序結(jié)果確定3種細(xì)菌作為進(jìn)一步研究對象，分別標(biāo)記為Z1、Z2和Z3。

1.3 形態(tài)特征觀察和生理生化實驗

首先對3種細(xì)菌進(jìn)行了革蘭氏染色，并采用穿刺法測定了其厭氧特性。菌株的形態(tài)特征采用日本日立掃描電鏡（S-4800）進(jìn)行觀察，樣品首先用2.5%戊二醛固定4 h，然后用0.1 mol/L 磷酸緩沖液清洗3次，每次15～30 min，最后用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和100%乙醇各洗脫30 min。觀察前通過日本日立臨界點干燥儀（HCP-2）進(jìn)行干燥，用電子濺射鍍膜儀（Gatan Model 682）在表面鍍一層15.0 nm厚度的金屬膜，再進(jìn)行觀察拍照。

接著，選擇初始pH值、溫度、NaCl濃度、碳源 4個參數(shù)的不同水平研究了菌株的生理生化特點。初始pH值的水平設(shè)為4、5、6、6.5、7、7.5，溫度水平設(shè)為15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%，碳源選擇蔗糖、淀粉、葡萄糖、丁酸鈉、丙酸鈉、乙酸鈉。實驗中，以2.0%（體積分?jǐn)?shù)）接種量將菌懸液接種到裝有10.0 mL培養(yǎng)液厭氧管中，分別在各參數(shù)的不同水平下培養(yǎng)24 h，以未接種的培養(yǎng)液作為空白對照，采用紫外分光光度計在波長660.0 nm處測定各組試驗的OD值。

1.4 產(chǎn)電性能測定

通過循環(huán)伏安法測定3株純菌的產(chǎn)電性能，實驗設(shè)置空白組和實驗組，空白使用無菌水溶液，實驗組為添加菌液的溶液。采用Ag/AgCl為參比電極，玻碳電極為工作電極，掃描速率50.00 mV/s，掃描范圍?600.00～600.00 mV。

采用單室MFC反應(yīng)器啟動，陽極和陰極分別采用碳布（2.0 cm×4.0 cm）和不銹鋼網(wǎng)（2.0 cm×4.0 cm），外阻為10 ?，以鈦絲構(gòu)成閉合回路，系統(tǒng)采用間歇式方式運行。啟動的接種污泥取自廈門市集美區(qū)污水處理廠二沉池，污泥的MLSS和MLVSS分別為16.78 g/L和9.2 g/L，陰極液和陽極液都為葡萄糖為碳源的營養(yǎng)緩沖液，并加入微生物生長所需的微量元素。將菌株Z1、Z2和Z3擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的菌懸液以1∶1∶1的體積比混合形成接種物，并以該接種物與 MFC接種污泥混合，考察了其對MFC啟動和產(chǎn)電性能的強(qiáng)化作用。試驗中設(shè)置實驗組R1和對照組R2，R1為加入5.0%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的產(chǎn)電菌混合物（OD660nm值為1.10）和15.0%接種污泥的MFC，R2為只有15.0% （接種污泥的MFC，兩組共運行3個周期，每個周期中當(dāng)輸出電壓值小于20.00 mV的時候更換營養(yǎng)液，進(jìn)入下一個周期的實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

通過厭氧培養(yǎng)和分離操作分離得到 3株純菌Z1、Z2和 Z3，將菌株的 16S rDNA序列提交GenBank，將其16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果表明，Z1與Citrobactersp.Z7和Citrobactersp.LY2兩種菌的相似性達(dá)到99.0%，Z2與Clostridiumsp.NHT33和Clostridiumsp.NHT54兩種菌的相似性達(dá)到 99.0%；Z3與Clostridiumsp.PPf35E10和Clostridiumsp.YN5兩種菌的相似性達(dá)到99.0%。以分離的3個菌株與其遺傳相似性較高的6個菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，菌株Z1屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），菌株Z2和Z3屬于梭菌屬（Clostridium）。雖然本研究中分離出來的Z1、Z2、Z3菌株分別與Citrobactersp.Z7、Clostridiumsp.NHT33、Clostridiumsp.PPf35E10等6株菌相似性較大，但關(guān)于此類菌株的生理生化特征及應(yīng)用領(lǐng)域的研究少見報道。因此，有必要對所分離菌株進(jìn)行生理生化特征及其在解決厭氧“發(fā)酵障礙”和MFC應(yīng)用潛力方面的探究。

2.2 菌株革蘭氏染色與SEM形態(tài)特征觀察

Hungate滾管固體培養(yǎng)基中3株菌落都接近圓形，直徑約0.5 cm，表面光滑，菌落邊緣整齊，中間顏色較深，邊緣顏色較淺。Z1有帶絲狀，為微黃色，Z2和Z3菌落為乳白色。革蘭氏染色結(jié)果表明，菌株Z1為革蘭氏染色陰性（G?），Z2和Z3為革蘭氏染色陽性（G+）。厭氧性測定結(jié)果為Z1為兼性厭氧菌，Z2和Z3為嚴(yán)格厭氧菌。圖2為3個菌株的SEM 照片，從中可以看出，菌株 Z1 、Z2 和 Z3的菌體均為桿狀，長約2.0～3.0 μm，寬約0.4～0.6 μm，單生，無鞭毛，Z1無芽孢，Z2和Z3有芽孢。菌株 Z1的上述特征與伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊中關(guān)于檸檬酸桿菌屬特征描述相符，而菌株Z2和Z3的上述特征則與梭菌屬的特征描述相符合[22-23]。

圖1 基于16S rDNA基因序列繪制的菌株Z1、Z2和Z3系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 菌株Z1、Z2和Z3的掃描電鏡圖像

2.3 菌株的生理生化特征

2.3.1 菌株生長的pH值范圍

pH值主要是從底物利用和對物質(zhì)代謝途徑兩方面影響微生物的生理活動[21]。如圖3(a)所示，在初始pH值7.0的條件下，Z3的長勢最佳，而菌株Z1和Z2的最佳長勢則出現(xiàn)在pH值為6.5時。隨著pH值的降低，3株菌的長勢逐漸下降，但pH值在5.0以上時，其生長代謝活性仍然較強(qiáng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸能力。與已報道的Clostridium屬菌株[16]相比，菌株Z2和Z3具有更寬的pH值生長范圍。在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)酸相的最佳 pH值范圍為 5.0～6.5，產(chǎn)甲烷相的最佳pH值范圍為6.5～7.5[24]。分析認(rèn)為，分離得到的 3株細(xì)菌，其適宜的增殖 pH值范圍（5～7.5）與厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)酸相和產(chǎn)甲烷相的適宜pH值具有很好的匹配性，具有互營共生的潛力。

2.3.2 菌株的生長溫度范圍

從圖3(b)中可以看出，在 15～40 ℃范圍內(nèi)，菌株Z1、Z2、Z3都能生長，但溫度的變化對菌株的生長影響顯著。從15 ℃開始，隨著溫度的升高，3個菌株的增殖加速，Z1的最適生長溫度為35 ℃，而Z2、Z3最適生長溫度為30 ℃，當(dāng)溫度高于最適溫度時，菌株的增殖受到抑制，長勢迅速下降。一般厭氧代謝體系的最佳溫度范圍為 25～35 ℃[25]，因此，菌株Z1、Z2和Z3在溫度方面也與厭氧發(fā)酵系統(tǒng)具有良好的匹配性。

2.3.3 菌株的NaCl濃度耐受范圍

圖3 菌株的生理生化特征

離子強(qiáng)度能對 MFC的產(chǎn)電性能產(chǎn)生重要影響，因為較高離子強(qiáng)度將有利于電子傳遞，但同時可能會影響電極膜上產(chǎn)電菌的活性[26]。由圖3(c)可知，菌株Z1、Z2和Z3在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時生長良好，隨著NaCl濃度增加生長速率下降，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5.0%時基本不生長，耐鹽性不強(qiáng)，其最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～2.0%。

2.3.4 不同碳源底物利用情況

從表1可以看出，3株菌株能都能利用蔗糖、淀粉、丙酸鈉、乙酸鈉作為碳源生長，Z2和Z3菌株還能夠利用葡萄糖作為碳源生長，Z1能夠利用丁酸鈉作為碳源生長。這與已有的研究相似，Park等[16]從以淀粉作為電子供體的 MFC中分離出來的丁酸梭菌（Clostridium butyricumEG3）能以淀粉、纖維二糖、蔗糖等為碳源；Niessen等[9]也發(fā)現(xiàn)同屬的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）能利用淀粉、葡萄糖和乳酸為碳源等產(chǎn)電。而本研究中分離出的3株產(chǎn)電菌不僅能以多糖（淀粉）為碳源，還能以厭氧代謝中間產(chǎn)物（揮發(fā)性有機(jī)酸）為碳源生長，這為其與厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸菌形成傳質(zhì)鏈的可行性提供了理論基礎(chǔ)。此外，菌株底物的廣譜性，對擴(kuò)大MFC的應(yīng)用范圍具有較大的指導(dǎo)意義。

表1 菌株碳源利用情況

2.4 產(chǎn)電活性試驗

2.4.1 循環(huán)伏安曲線測定

在循環(huán)伏安曲線中，峰高越高，氧化還原電勢越高，細(xì)菌的產(chǎn)電能力越強(qiáng)，產(chǎn)電性能越好[27]。如圖4所示，菌株Z1、Z2和Z3在?0.29 V左右都出現(xiàn)了明顯的還原峰，氧化峰不明顯，表明3株菌株具有相似的產(chǎn)電特征，且還原能力較強(qiáng)。在目前研究獲得的產(chǎn)電菌，大多具有較強(qiáng)的氧化能，而還原能力較強(qiáng)的產(chǎn)電菌報道較少[28～30]，這可能與大部分研究關(guān)注于產(chǎn)電菌在 MFC陽極發(fā)揮作用有關(guān)[31]。然而，對于 MFC中應(yīng)用較為普遍的催化陰極（鉑和鎳等）而言，因其在反應(yīng)中容易失活，而造成反應(yīng)體系不穩(wěn)定[32]。因此，對生物陰極的研究需要加強(qiáng)，而且生物陰極的還原特性使其在高氯酸鹽降解、重金屬修復(fù)以及生物質(zhì)能源產(chǎn)生方面具有較大應(yīng)用前景[33-35]。

圖4 菌株循環(huán)伏安曲線

2.4.2 產(chǎn)電菌對MFC啟動和產(chǎn)電性能的影響

MFC啟動運行結(jié)果見圖5。由圖5可見，在MFC啟動運行的第一個周期中，R1運行12 天后，系統(tǒng)的輸出電壓即達(dá)到了20.00 mV，最高輸出電壓達(dá)到350.00 mV。而R2運行15 天后期系統(tǒng)輸出電壓方達(dá)到20.00 mV，其最高輸出電壓為317.80 mV?？梢姡a(chǎn)電菌的加入，不僅可以提高 MFC的反應(yīng)周期，而且可以有效提高 MFC的產(chǎn)電效能。在隨后的兩個運行周期中，R1和R2的最大輸出電壓具有顯著提高，但基本穩(wěn)定，分別維持在482.50 mV和408.60 mV左右，也即R1的最大輸出電壓較R2增加了18.1%。

圖5 MFC啟動運行

分析認(rèn)為，MFC在每個運行周期所表現(xiàn)出的電壓迅速升高現(xiàn)象，是源于底物的充足。而隨著有機(jī)物的不斷降解，微生物因營養(yǎng)逐漸匱乏而活性下降，導(dǎo)致了MFC輸出電壓的降低。MFC的啟動實際上是產(chǎn)電菌和其他種群微生物競爭后，在電極表面附著從而形成生物膜，同時轉(zhuǎn)移電子和輸出電壓的過程。所以，產(chǎn)電菌的種類及能否形成優(yōu)勢種群是MFC成功啟動的關(guān)鍵影響要素。R1中接種入分離的產(chǎn)電菌株后，豐富了產(chǎn)電菌的種類，增加了產(chǎn)電菌數(shù)量，從而有效縮短了運行周期，提高了輸出電壓。而這一結(jié)果同時證明了菌株Z1、Z2和Z3能夠在以葡萄糖為底物、活性污泥為種源的 MFC系統(tǒng)中具有較強(qiáng)的生存能力，表現(xiàn)出了良好的種群競爭優(yōu)勢，可為強(qiáng)化MFC效能提供微生物種質(zhì)資源。

3 結(jié) 論

（1）從MEC陰極的生物膜上分離得到3株產(chǎn)電菌 Z1、Z2和 Z3，Z1屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），Z2和 Z3屬于梭菌屬（Clostridium），3株菌株均具有較強(qiáng)還原能力。

（2）菌株Z1、Z2和Z3均為桿狀菌。其中，Z1為G－，Z2和Z3為G+。Z1為兼性厭氧菌，Z2和Z3為嚴(yán)格厭氧菌。3株產(chǎn)電菌能夠利用淀粉、單糖和揮發(fā)性脂肪酸為碳源生長。在pH值5～7.5的環(huán)境中增殖良好。Z1的最適生長溫度為35 ℃，Z2、Z3最適生長溫度為30 ℃。3株菌株在生理生態(tài)特征方面與厭氧發(fā)酵系統(tǒng)具有良好的匹配性能。

（3）在MFC啟動時，加入菌株Z1、Z2和Z3的混合物，可顯著縮短 MFC的啟動周期，同時有效提高M(jìn)FC的產(chǎn)電效能。

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