出血性腦卒中患者急性期外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量變化的初步研究

宋黃成 張 松 朱為民 虞 聰 俞俊杰 劉一坤 袁斌斌

1）江蘇海門市人民醫(yī)院神經(jīng)外科 海門 226100 2）復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科 上海 200040

腦卒中（Stroke）具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率，是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的三大主要疾病之一。隨著當(dāng)今社會(huì)的老齡化，腦卒中發(fā)病率還在不斷增高。腦卒中高居西方發(fā)達(dá)國家人口死亡原因第3位，也是導(dǎo)致殘疾的首要原因。在我國，腦卒中是目前發(fā)病率、致死率、致殘率占首位的疾病。全球每年有554萬人死于腦卒中［1］。我國每年有近150萬人死于腦卒中，并新增200萬患有殘疾的幸存者。隨著我國人口老齡化的加速，我國腦卒中的發(fā)病率正以每年近9%的速度上升，腦卒中已成為威脅老年人健康的主要疾病之一。腦卒中包括缺血性和出血性卒中兩種。腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是常見的腦血管類疾病，屬于腦卒中的一種，占卒中發(fā)病率的15%。因發(fā)病原因不同分為兩類，第一類是高血壓性腦出血，由于高血壓導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化及淀粉樣病變從而引起腦出血，這是腦出血中的主要類型；第二類是由于動(dòng)靜脈畸形（AVM）、動(dòng)脈瘤（aneurysm）及其他凝血功能紊亂造成的腦出血。高血壓腦出血常發(fā)生于大腦半球深部的基底節(jié)區(qū)域，主要出血部位在腦內(nèi)毛細(xì)血管級(jí)別的小血管中，如大腦中動(dòng)脈的二級(jí)分支豆紋動(dòng)脈、基底動(dòng)脈的腦橋支等。出血型腦卒中相對(duì)于缺血型腦卒中具有更高的病死率和致殘率，我國每年130萬～150萬人發(fā)病，病死率為40%～60%，存活者遺留嚴(yán)重殘疾的約占40%。

Asahara等［2］于1997年首次從外周血單核細(xì)胞中提取出具有干細(xì)胞的增殖能力的CD34（＋）的細(xì)胞亞群，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其可以分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞并命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，EPC在特定細(xì)胞因子（VEGF、GM－CSF、SDF－1、IL－6、EPO、Statins等）的趨化作用下迅速集中于血管損傷或內(nèi)膜缺損部位，維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性并參與血管的修復(fù)和再生。大量的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)已證實(shí)增加外周血中功能性EPC的含量或動(dòng)員內(nèi)源性的EPC均可保護(hù)機(jī)體血管內(nèi)皮系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，防止內(nèi)皮損傷所造成的病變進(jìn)一步加重［3－5］。目前外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞可作為評(píng)估患者內(nèi)皮損傷程度和血管修復(fù)能力的重要指標(biāo)。有實(shí)驗(yàn)研究指出，在大鼠腦出血后，血管新生的相關(guān)因子的表達(dá)量會(huì)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血后檢測到VEGF、Flt－1和Flk－1等血管新生的相關(guān)因子表達(dá)量上調(diào)［6］，認(rèn)為腦出血可引起血管新生。而內(nèi)皮祖細(xì)胞作為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，必然參與血管新生和血管修復(fù)的過程。至今國內(nèi)關(guān)于出血性腦卒中患者外周血中急性期內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量變化的研究少有報(bào)道，本文將通過初步檢測3例急性腦出血的患者第1～10天外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量變化和部分功能研究，探討出血性腦卒中患者急性期外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象急性腦出血患者3例（具體資料見表1），來源于本院2013－01—02住院患者，其中左側(cè)基底節(jié)區(qū)腦出血2例，出血量分別為50mL和90mL（破入腦室），右側(cè)基底節(jié)區(qū)腦出血1例，出血量為20mL。如圖1所示。

1.2儀器FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品，用CELLQuest軟件（BD公司）獲取和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。SF 23000血球計(jì)數(shù)儀，日本東亞公司產(chǎn)品。

1.3試劑CD34－PE單抗，同型對(duì)照IgGa2PE、KDR－APC均由德國美天旎公司提供，紅細(xì)胞裂解液由美國BD公司提供，EGM－2細(xì)胞培養(yǎng)液由美國LONZA公司提供，人纖維連接蛋白由Sigma公司提供，Dil標(biāo)記的乙?；兔芏扔蒑olecular Probes公司提供，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Ⅰ型荊豆凝集由Sigma－Aldrich公司提供，DAPI由 Molecular Probes公司提供，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板由美國Corning公司提供，PBS由美國Gibco公司提供。

圖1 3例高血壓腦出血患者急診入院頭顱CT顯示出血情況 a為60歲左側(cè)基底節(jié)區(qū)腦出血的患者，出血量約50mL，b為約50歲左側(cè)基底節(jié)區(qū)腦出血的患者，出血量約20mL，c為約80歲左側(cè)基底節(jié)區(qū)腦出血的患者，出血量約為90mL，且破入腦室

表1 3例病人的資料

2 方法

2.1標(biāo)本處理采集EDTA.K2抗凝的靜脈血1～2mL，加入1X紅細(xì)胞裂解液10mL，混勻，室溫孵育15min，1 000 rpm離心5min。棄上清，混勻，加入3～5mL PBS，1 000 rpm離心5min×2次。棄上清，加入80μL PBS重懸后加入10μL CD34－PE和10μL KDR－APC抗體并置于4℃暗室孵育30min后，1 500rpm離心5min。棄上清，加入500μL PBS重懸后，1 500rpm離心5min×2次。棄上清，加入400 μL PBS重懸后至流式管中上機(jī)檢測。對(duì)照管中作類似處理。

2.2儀器設(shè)置和數(shù)據(jù)分析用FACSComp調(diào)整FSC、SSC、FL2和FL3電壓。用CELL Quest軟件獲取100000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。以對(duì)數(shù)FSC作為X軸，對(duì)數(shù)SSC作為Y軸，選取有核細(xì)胞圈門P2。以對(duì)數(shù) KDR－APC作為 X軸，對(duì)數(shù)SSC作為Y軸，F(xiàn)ormat P3到本窗中，選取KDR陽性細(xì)胞圈門P3。另開一個(gè)窗，以對(duì)數(shù)CD34－PE作為X軸，對(duì)數(shù)SSC作為Y軸，F(xiàn)ormat P3到本窗中。以對(duì)照管調(diào)整mark的位置。在同等的實(shí)驗(yàn)條件下，用以分析測定管（見圖2）。P4框內(nèi)即為循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞群值。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料用（s）表示，2組間均數(shù)比較采用ANOVA檢驗(yàn)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞圖（P4框內(nèi)為循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞群）

3 結(jié)果

3.1 3例腦出血患者第1～第10天外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的測定結(jié)果（見圖3）。從圖3a我們看出，50歲和60歲患者在出血的超急性期外周血中EPC含量很高，幾乎為急性期的最高峰，然后隨時(shí)間延長其含量逐漸降低，第4天幾乎達(dá)到最低值，術(shù)后第7天和第5天再次升高。而80歲患者在急性期第2天外周血中EPC達(dá)到最高峰，然后隨時(shí)間逐漸下降，第6天再次達(dá)到高峰。而圖3b通過統(tǒng)計(jì)分析可以得出，腦出血患者在超急性期EPC被大量動(dòng)員，達(dá)到最高峰，然后隨時(shí)間延長其含量逐漸降低，第4天降到最低值，第7天再次達(dá)到一個(gè)新的峰值。

圖3 圖a示分別測定3例腦出血患者第1～第7及第10天外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化情況，b示3例患者第1～第7及第10天外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的整體變化趨勢

3.2 50歲患者外周血中超急性期內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定在第2例患者入院當(dāng)天通過流式檢測該病人外周血中EPC含量很高，遂在病人知情同意下通過靜脈抽取肝素抗凝的外周血20mL，用PBS等倍稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液，通過密度梯度離心的方法提取單核細(xì)胞（如圖4）。然后將細(xì)胞按照密度為1×106個(gè)／L接種在加有EGM－2完全培養(yǎng)液的預(yù)涂纖連蛋白的6孔培養(yǎng)板中，置37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后換液，將未貼壁細(xì)胞棄之。此后每隔3d更換培養(yǎng)液。每天拍照觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化（如圖5）。并對(duì)細(xì)胞行內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞功能測定（Dil－ac－LDL與FITC－UEA－1）和流式鑒定［CD31（＋）KDR（＋）］。見圖6。

圖4 密度梯度離心法提取外周血MNC 下面箭頭所指為外周血加入淋巴細(xì)胞分離液離心后看到的明顯的白沫層，即單核細(xì)胞層

4 討論

內(nèi)皮祖細(xì)胞于1997年被Asahara等［2］學(xué)者在外周血中首次發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞在各種趨化因子的誘導(dǎo)下能夠從骨髓中動(dòng)員，遷移并聚集到血管損傷部位，替換受損的內(nèi)皮細(xì)胞并分化成成熟的內(nèi)皮細(xì)胞從而保持內(nèi)膜完整，維持血管內(nèi)皮系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，并可作為評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能的一個(gè)有效標(biāo)志物［7－8］。目前尚無關(guān)于內(nèi)皮祖細(xì)胞表面抗原特異性鑒定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但普遍認(rèn)為CD34（＋）KDR（＋）細(xì)胞為外周血中循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞，因此本文也將二者雙陽性的細(xì)胞定義為PBEPC（如圖2）。

高血壓腦出血，因腦血管破裂引起腦血流循環(huán)障礙和腦組織功能或結(jié)構(gòu)的損害，又稱為出血性腦卒中。組織病理證實(shí)高血壓患者血管病理變化主要為細(xì)動(dòng)脈的硬化。因此在腦血管破裂前，患者必定存在血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。而內(nèi)皮祖細(xì)胞目前可作為一個(gè)良好評(píng)估血管內(nèi)皮功能的maker，同時(shí)其數(shù)量和功能可作為血管修復(fù)能力的一個(gè)有效指標(biāo)。我們通過檢測3例高血壓腦出血患者連續(xù)7d和第10d外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化，觀察3例高血壓腦出血病人在出血急性期骨髓中的EPC被大量動(dòng)員，并隨時(shí)間推移EPC被消耗，而出血后第7天EPC再次在外周血中達(dá)到高峰。因此我們的假設(shè)是在高血壓腦出血的急性期，由于損傷血管釋放IL－6、TNF－α等趨化因子，骨髓池中的EPC被募集到血管損傷部位，從而參與血管的修復(fù)。而無論是開顱血腫清除術(shù)抑或是保守治療，隨著血腫的減少或吸收和血腫周圍水腫的逐漸減輕，破裂血管周圍腦組織的功能恢復(fù)乃至神經(jīng)再生非常依賴新生的血管。血管新生的一種是從已有的血管上長出芽孢從而形成新的毛細(xì)血管［9］。而內(nèi)皮祖細(xì)胞作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞也必然參與血管新生的過程。故出血后第7天再次達(dá)到高峰。同時(shí)發(fā)現(xiàn)EPC的動(dòng)員與年齡有一定的相關(guān)性，年齡越大，動(dòng)員能力越差。圖3a顯示80歲患者在超急性期外周血EPC未達(dá)到最高峰，相反在出血后第1天達(dá)到峰值，而且急性期總體動(dòng)員能力遠(yuǎn)不如50歲和60歲患者。說明EPC的動(dòng)員能力可能隨年齡增長減弱。通過前文論述推測，在同齡同部位同出血量情況下，排除影響EPC的諸多因素外，EPC的動(dòng)員和患者的預(yù)后存在一定的相關(guān)性。另外，我們通過培養(yǎng)某一超急性期外周血EPC含量最高患者的單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該患者在接種時(shí)即有很多小錘狀的細(xì)胞，而培養(yǎng)1周左右該細(xì)胞便大量增殖并形成類似晚期EPC的旋渦狀，而進(jìn)一步的培養(yǎng)并未形成晚期EPC。我們猜想：該患者被大量動(dòng)員到外周血的EPC，也許較正常人存在功能上的某些缺陷，從而無法形成典型的鋪路石樣晚期EPC。由于無法培養(yǎng)出晚期EPC，我們無法與正常人進(jìn)行克隆增殖能力、成管能力、遷移能力的比較，從而無法準(zhǔn)確進(jìn)行細(xì)胞功能的鑒定。但該患者從一定意義上說明了高血壓腦出血患者外周血中EPC存在功能缺陷。另外，通過對(duì)3例患者急性期每天CCS評(píng)分發(fā)現(xiàn)，外周血中EPC含量高的患者恢復(fù)相對(duì)較快。如前文所述，腦出血本身可引起血管新生，毫無疑問，EPC參與血管新生，且含量越高，越能促進(jìn)和加快血管新生，從而改善卒中區(qū)腦組織血供，改善患者預(yù)后。EPC變化可能與腦卒中的預(yù)后有密切關(guān)系，有望作為出血性腦卒中預(yù)后觀察的指標(biāo)。

查閱國內(nèi)文獻(xiàn)，多數(shù)研究集中于出血性腦卒中患者急性期內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）數(shù)量的變化與卒中危險(xiǎn)因素或炎癥因子方面［10－12］，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道腦卒中患者急性期外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員情況和細(xì)胞功能變化。我們初步探討了3例高血壓腦出血患者急性期外周血中EPC的變化，雖然在一定層面上說明了EPC的動(dòng)員情況和部分功能變化，但由于樣本量太小，無確切的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，今后大樣本的出血性腦卒中患者急性期外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能變化有待進(jìn)一步研究。

圖5 在低細(xì)胞密度、低血清環(huán)境下分離和純化的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMMNs），于含有VEGF、FGF、IGF－1、EGF等生長因子的環(huán)境中成功培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細(xì)胞（PBEPCs）。a為剛接種的細(xì)胞，箭頭所示為如同錘狀的不規(guī)則細(xì)胞，可能為動(dòng)員到外周血中的EPC；c為接種1周后細(xì)胞形成漩渦狀，如同晚期EPC形態(tài)，d為20倍鏡看到的典型的早期EPC形態(tài)，紡錘狀不規(guī)則形態(tài)；e為接種近2周后細(xì)胞的狀態(tài)，形成具有克隆能力的“集落”；g為接種近3周時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)，未看到典型的鵝卵石或鋪路石樣的晚期EPC。a，c，e，g分別為10倍鏡圖，標(biāo)尺為200μm；b，d，f，h為20倍鏡圖，標(biāo)尺為100μm

圖6 a：人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞免疫熒光鑒定 Dil－ac－LDL與 FITC－UEA－1熒光雙染（c）（DiI－acLDL為紅色，F(xiàn)ITC－UEA－1為綠色，Dapi為藍(lán)色；b：EPC流式鑒定結(jié)果：CD31 99.6%（d），KDR 85.5%（e），CD31（＋）KDR（＋）90.7%（f）

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