真核表達(dá)載體PEGFP-N1-IL-2的構(gòu)建

劉秋霞 馮軍 趙志國(guó) 劉冰慧 龔志平

白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由T輔助細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)的目的就是克隆IL-2基因?yàn)橄乱徊絀L-2cDNA導(dǎo)入其他細(xì)胞為其臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6小鼠、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒 PEGFP-N1載體、SuperscriptTMIII/RNaseOutTM Enzyme Mix(Invitrogen公司)、Pfu DNA聚合酶(北京天為時(shí)代科技有限公司)、T4 DNA 連接酶、BamH I、KpnI、BglII(Takara公司)、RNA提取試劑盒、RT試劑盒、PCR試劑盒(Invitrogen公司)、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取與純化試劑盒(Promega公司)、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA、PCR Markers(北京天為時(shí)代科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取:頸脫位處死C57BL/6小鼠，無(wú)菌摘除脾臟，使用RNA提取試劑盒提取RNA并進(jìn)行完整性及純度測(cè)定。

1.2.2 RT-PCR:按照Genebank提供的序列，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成引物。分別為:β-actin:上游5’＞CCCCAAGGCCAACCGTGAA ＜3’下游5’＞CGGAATCGCTCGTTGCCAATGT＜3’擴(kuò)增產(chǎn)物為 435 bp。IL-2:1:5’-CCTTGCTAATCACTCCTCAC 2:5’-TATGTGTTGTAAGCAGGAGG擴(kuò)增產(chǎn)物為510 bp。參照RT試劑盒、PCR試劑盒(Invitrogen公司)試劑盒說(shuō)明，得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如見(jiàn)到預(yù)期510 bp大小的 DNA條帶，則表明 IL-2cDNA擴(kuò)增成功。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收與純化:取PCR后產(chǎn)物按照DNA凝膠回收試劑盒(Promega公司)進(jìn)行回收與純化。

1.2.4 真核表達(dá)載體PEGFP-N1-IL-2的構(gòu)建:分別取用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和KpnI雙酶切后的PCR產(chǎn)物和用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、限制性?xún)?nèi)切酶KpnI雙酶切后質(zhì)粒PEGFP-N1大片段，加入T4DNA連接酶作定向連接，將連接體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，于37℃培養(yǎng)16 h待菌落長(zhǎng)出。挑取一個(gè)長(zhǎng)出的菌落加入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，放入37℃搖床中250 r/min搖菌過(guò)夜培養(yǎng)12 h后用質(zhì)粒提取試劑盒按照其操作說(shuō)明提取質(zhì)粒。取部分提取的質(zhì)粒為模板，以PCR引物Primer1、Primer2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳帶，鑒定融合質(zhì)粒PEGFP-N1-IL-2構(gòu)建是否成功。

1.2.5 序列分析:取上述經(jīng)PCR鑒定的菌液送測(cè)序公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠脾組織總RNA的提取 以C57BL/6小鼠脾組織為原材料提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定表明OD260/OD280=1.845，1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示28S.18S.5S三條明顯條帶，且28S＞18S，說(shuō)明提取的總RNA完整且純度符合反轉(zhuǎn)錄要求。見(jiàn)圖1。

2.2 RT-PCR 用所提取的總RNA和Primer1.Primer2.進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參照，其產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示一條510 bp預(yù)期長(zhǎng)度的條帶，與目的基因長(zhǎng)度一致。說(shuō)明IL-2 mRNA提取成功，逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA完整，初步證明目的基因克隆成功。見(jiàn)圖2。

2.3 擴(kuò)增片段的基因克隆 將RT-PCR純化產(chǎn)物與質(zhì)粒PEGFP-N1分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Kpn I雙酶切后，加入T4DNA連接酶作定向連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PEGFP-N1-IL-2。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示重組質(zhì)粒PEGFP-N1-IL-2構(gòu)建成功。見(jiàn)圖3。

圖1 總RNA

圖2 RT-RCR顯示510 bp預(yù)期長(zhǎng)度條帶

圖3 擴(kuò)增片段的基因克隆

2.4 克隆片段的DNA序列分析 將重組質(zhì)粒PEGFP-N1-IL-2送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與Genebank中小鼠IL-2cDNA(K02292)序列完全一致。見(jiàn)圖4。

圖4 IL-2cDNA序列

3 討論

細(xì)胞因子是由機(jī)體活化的免疫細(xì)胞及某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。其主要的生物學(xué)功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)。IL-2是其中一種，1976年Morgan等發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有一種刺激胸腺細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，由于這種因子能促進(jìn)和維持T細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)，稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor，TCGF)，1979 年統(tǒng)一命名為 IL-2。IL-2 分子量為15.5 ku的蛋白質(zhì)分子，由133個(gè)氨基酸殘基組成，有多重生物學(xué)功能，主要是促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化［1］;調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞并保持它的自然殺傷力［2］;誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生;促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖作用;與其他細(xì)胞因子的協(xié)同作用［3］;可激活產(chǎn)生淋巴因子的殺傷(LAK)細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)，刺激B細(xì)胞增殖分化和分泌抗體，并可誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌 IFN-γ、TNF、CSF 等細(xì)胞因子等［4］，多重免疫學(xué)功能使其在多領(lǐng)域被廣泛研究并在臨床應(yīng)用方面發(fā)揮著重要的作用，尤其對(duì)腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、白血病、肺癌、癌性胸腹水等的治療、抗感染、自身免疫性疾病等方面都有一定的應(yīng)用。IL-2的血漿半衰期僅約為2 h，臨床上為維持其療效常須大劑量頻繁注射，這不僅導(dǎo)致其毒性增加，還提高了治療成本。它的毒副作用主要會(huì)出現(xiàn)感冒樣癥狀如寒戰(zhàn)、頭痛，胃腸道反應(yīng)惡心、嘔吐、等，毛細(xì)血管滲漏綜合征(CLS)如少尿、水腫、低血壓等，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如焦慮、幻覺(jué)、昏迷等，感染，貧血等。為了克服IL-2半衰期短和病灶局部量不足的這些缺點(diǎn)，比如利用轉(zhuǎn)基因表達(dá)IL-2治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究中，將攜帶IL-2基因的真核表達(dá)載體直接導(dǎo)入病灶，有可能發(fā)展成為腫瘤治療的有效方法［5］。所以我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體PEGFP-N1-IL-2，為其下一步轉(zhuǎn)染到真核或原核細(xì)胞持續(xù)分泌IL-2更有效的應(yīng)用于臨床作準(zhǔn)備。目前，對(duì)于IL-2的研究日益加深，對(duì)于其在臨床治療上起到了不可忽視的作用，但在某些方面還存在一些分歧，有待進(jìn)一步研究。

1 Lan RY，Selmi C，Gershwin ME.The regulatory，inflammatory，and T cell programming roles of interleukin-2(IL-2).Autoimmun，2008，31:7-12.

2 Gruenbacher G，Gander H，Nussbaumer O，et al.IL-2 costimulation enables statin mediated activation of human NK cells，preferentially through a mechanism involving CD56+dendritic cells.Cancer Res，2010，70:9611-9620.

3 Yang H，Cheng EY，Sharma VK，et al.Dendritic cells with TGF-1 and IL-2 differentiate naive CD4+T cells into alloantigen specific and allograft protective Foxp3+regulatory T cells.Transplantation，2012，93:580-588.

4 Vella AT，Dow S，Potter TA，et al.Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:3810-3815.

5 金曉凌，井清源，王炳生，等.瘤體內(nèi)直接注射白介素-2質(zhì)粒復(fù)合物治療小鼠肝癌.中國(guó)腫瘤臨床，2001，28:779-782.