正交試驗優(yōu)選山銀花的微波滅菌工藝研究

彭艷梅，謝 誼，楊 瑛*，馬 薇

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

正交試驗優(yōu)選山銀花的微波滅菌工藝研究

彭艷梅1，謝 誼1，楊 瑛2*，馬 薇2

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的采用正交試驗優(yōu)選山銀花的微波滅菌工藝。方法以滅菌率及綠原酸的含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗對滅菌時間、滅菌功率、藥材鋪層厚度進(jìn)行考察，并考察最佳微波滅菌工藝對綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷含量的影響。結(jié)果篩選出最佳微波滅菌工藝參數(shù)：滅菌時間9 min、滅菌功率8 kW、藥材鋪層厚度3 cm。其綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷含量略有下降。結(jié)論優(yōu)選的微波滅菌工藝滅菌效果好，有效成分損失少，操作簡便，適合大生產(chǎn)。

山銀花；微波；滅菌；正交試驗

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛的干燥花蕾或初開的花。具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用。用于癰腫療瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫?zé)岚l(fā)病[1]。山銀花的主產(chǎn)區(qū)在湖南隆回縣小沙江、重慶的秀山、彭水等地。由于山銀花采收季節(jié)為5月初至7月上旬的春夏季節(jié)，常遇陰雨天氣，采集的花蕾得不到及時干燥，藥材易霉變，一些藥材加工基地不得已采用硫黃熏蒸[2-3]的方法，導(dǎo)致山銀花藥材二氧化硫含量超標(biāo)，制約了山銀花的生產(chǎn)及銷售。目前中藥材常用的滅菌方法有蒸汽滅菌、輻照滅菌、微波滅菌等，每種方法都各有其特點。由于微波具有穿透力強、殺菌效率高、速度快、環(huán)保等優(yōu)點，在中藥材及其制劑滅菌方面已有應(yīng)用[4-6]。為尋求較理想的山銀花干燥滅菌方法，本實驗將微波技術(shù)應(yīng)用于山銀花藥材的滅菌，并對其微波滅菌工藝進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

HWZ-10B-I箱式微波真空干燥設(shè)備（天水華圓制藥設(shè)備科技有限責(zé)任公司，工作頻率2 450 MHz，微波功率10 kW）；島津LC-20A高效液相色譜儀。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （購自北京三藥科技開發(fā)有限公司）；山銀花（采自湖南省隆回縣小沙江鎮(zhèn)），經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院生藥室鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）的花及花蕾；綠原酸對照品（批號：11753-200413）、灰氈毛忍冬皂苷（批號為：12022804，純度≥98%）均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗方案及結(jié)果

由于滅菌時間、滅菌功率、藥材鋪層厚度是影響滅菌效果的主要因素，故以滅菌時間、滅菌功率、藥材鋪層厚度為考察因素，選擇滅菌效果、綠原酸含量(以干燥品計)為評價指標(biāo)，在平行操作條件下，按L9(34)正交表安排試驗，設(shè)置微波干燥箱溫度65℃，按表1對應(yīng)的參數(shù)，將一定量的新鮮山銀花均勻平鋪于微波干燥箱內(nèi)的不銹鋼盤內(nèi)，以一定的滅菌時間和滅菌功率對山銀花進(jìn)行滅菌處理。滅菌結(jié)束后，立即裝入已滅菌的容器，按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢ微生物限度檢查法，對其細(xì)菌數(shù)進(jìn)行檢測；干燥后的山銀花中綠原酸含量測定參照《中華人民共和國藥典》2010版山銀花含量測定項下進(jìn)行檢測。對正交試驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析來優(yōu)選山銀花藥材微波滅菌的最佳工藝參數(shù)，因素水平見表1、結(jié)果見表2、方差分析見表3。HPLC圖見圖1-6。

表1 微波滅菌工藝的因素水平表

表2 微波滅菌工藝正交試驗方案及結(jié)果表

2.2 正交試驗結(jié)果方差分析

為篩選出山銀花的最佳滅菌工藝參數(shù)，對正交試驗結(jié)果分別進(jìn)行方差分析，以此來確定最佳微波滅菌工藝參數(shù)，方差分析結(jié)果分別見表3、表4。

表3 滅菌效率的方差分析表

圖1 綠原酸對照品HPLC圖

圖2 樣品（滅菌前）綠原酸含量測定HPLC圖

圖3 樣品（滅菌后）綠原酸含量測定HPLC圖

由滅菌效率的方差分析結(jié)果可知：A因素有非常顯著性統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01），B、C因素?zé)o統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），由極差分析可得，對滅菌效率的影響順序為：A＞B＞C，即：微波功率＞滅菌時間＞鋪層厚度；由極差分析可得：A 因素中 A3＞A2＞A1，選擇最好水平 A3，B 因素中 B3＞B2＞B1， 選擇最好水平 B3，C 因素中 C3＞C2＞C1，選擇最好水平 C3，上述分析結(jié)果表明最佳工藝組合為A3B3C3。

表4 綠原酸含量的方差分析表

圖4 皂苷對照品HPLC圖

圖5 樣品（滅菌前）皂苷含量測定HPLC圖

圖6 樣品（滅菌后）皂苷含量測定HPLC圖

由綠原酸含量的方差分析結(jié)果可知：A、B、C因素均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），由極差分析可得，對綠原酸含量的影響順序為：A＞B、C，即：微波功率＞滅菌時間>鋪層厚度；由極差分析可得：A因素中A1＞A2＞A3，選擇最好水平 A1，B 因素中 B1＞B2＞B3，選擇最好水平 B1，C 因素中 C3＞C2、C1， 選擇最好水平 C3，上述分析結(jié)果表明最佳工藝組合為A3B3C3。即最佳微波滅菌工藝參數(shù)：滅菌時間9 min、滅菌功率8 kW、藥材鋪層厚度3 cm。

2.3 工藝驗證

按優(yōu)選工藝平行制備3份樣品，設(shè)置微波真空干燥箱溫度65℃，將山銀花鋪3 cm的厚度，均勻平鋪于微波真空干燥箱的盤中，滅菌時間為9 min，滅菌功率為8 kW，對其進(jìn)行滅菌處理。測定滅菌前后山銀花的細(xì)菌數(shù)、綠原酸及灰氈毛忍冬皂苷的含量，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果

3 討論

微波是一種超高頻電磁波，具有很強的穿透作用，可以在藥材顆粒內(nèi)外同時均勻、迅速地加熱。它可使具有永久偶極的分子產(chǎn)生高達(dá)4.9×109次/s的共振頻率，使分子平均動能迅速增加[7]。微波滅菌的原理是兩方面的，它既有熱效應(yīng)滅菌，又有非熱效應(yīng)滅菌，因此具有雙重殺菌功能。微波加熱時，細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸成分等分子極性基團(tuán)在微波場下高速旋轉(zhuǎn)、振動，一方面加熱使細(xì)菌蛋白質(zhì)凝固而死亡；另一方面也可以使蛋白質(zhì)、核酸變性而死亡。利用脈沖調(diào)制的微波能進(jìn)行殺菌試驗，可以用較小的溫升達(dá)到殺菌的目的。這說明微波殺菌不只是熱力殺菌，還有非熱力致死細(xì)菌的能力，這就是所謂的非熱效應(yīng)[8-9]。根據(jù)這個原理，可以在極短的時間內(nèi)采用高于常規(guī)微波場能量密度的數(shù)倍或數(shù)十倍的脈沖微波能量，不但可以殺死細(xì)菌，還可大大降低藥品溫升，降低設(shè)備的能耗。

通過實驗確定山銀花藥材的最佳微波滅菌工藝參數(shù)為：滅菌功率8 kW、藥材鋪層厚度3 cm、滅菌時間9 min。在該條件下，滅菌前后的山銀花中綠原酸及灰氈毛忍冬皂苷的含量無明顯變化，滅菌效率達(dá)到96%，滅菌效果良好。關(guān)于微波對霉菌、大腸菌群等微生物指標(biāo)的影響有待進(jìn)一步研究。

[1]中華人民共和國藥典編輯委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：28-29．

[2]黃 佳，虢小翊，彭國平，等.山銀花皂苷提取條件優(yōu)化研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（5）：85-87.

[3]楊 瑛，彭艷梅.市售10種中藥飲片中二氧化硫殘留量測定[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，32（1）：38-39.

[4]王立成，周興軍.藥物滅菌技術(shù)及其對中藥的影響[J].實用藥物與臨床，2008，11(6)：375-376.

[5]黃玉蘭，李鎮(zhèn)濤，呂 謙.中藥制劑微生物污染的因素及對策[J].藥物評價研究，2011，34(3)：204-207.

[6]陳金傳.微波能在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用[J].中草藥，2001，32(9)：附1-2.

[7]曾昭鈞，李香文.微波有機化學(xué)進(jìn)展 [J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1999，16(4)：304-309.

[8]England JM，Rowan RM，Van Assendelft OW，et al.Guidelines for the evaluation ofblood cellanalysersincluding those used for differential leucocyte and reticulocyte counting and cell marker applications[J].Clin Lab Haemat，1994，16(2)：157-174.

[9]王麗萍.目前中藥制劑主要滅菌方法及其存在問題[C].2009年全國中藥學(xué)術(shù)研討會論文集.貴陽：中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會，2009：92-94.

（本文編輯 匡靜之）

Study on Optimum Microwave Sterilization Process of Lonicera confuse by Orthogonal Test

PENG Yanmei1,XIE Yi1,YANG Ying2*,MA Wei2
(1.Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410013,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo optimiz the parameters of microwave sterilization process for lonicera confuse by orthogonal test.MethodsDisinfection rate and the content of chlorogenic acid were taken as indexes to choose the better process parameters.The sterilizing time,power and layer thickness of herbs were investigated by L9(34)orthogonal test.Meanwhile,we investigated their effects on the contents ofchlorogenic acid and macranthoidin.ResultsThe optimalcombination ofprocess parameterswere 9 min sterilizing time,8 kW microwave powerand 3 cm layerthickness.ConclusionThe optimal combination of process would be applied to large-scale production with the advantages of good sterilization effect,less loss of active ingredients,and the convenient operation.

Lonicera confuse;microwave;sterilization;orthogonal test

R282.4

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.11.006.021.04

2014-07-21

長沙市科技局科技攻關(guān)資金專項資助（K1203019-31）。

彭艷梅，女，副研究員，主要從事中藥制劑與分析研究。

* 楊 瑛，女，研究員，E-mail：fanfeihe@126.com。

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