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    響應(yīng)面法優(yōu)化熱泉菌Bacillus sp.Lc50-1的發(fā)酵產(chǎn)卡拉膠酶條件*

    2014-10-08 12:49:28胡秋實(shí)蘇忠亮何培青
    海洋科學(xué)進(jìn)展 2014年2期
    關(guān)鍵詞:等高線圖卡拉膠面法

    胡秋實(shí),蘇忠亮,何培青,李 江

    (1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,青島 山東 266042;2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所,青島 山東 266061)

    卡拉膠是紅藻細(xì)胞壁中的一種親水性多糖,是由重復(fù)的α-(1,4)-D-吡喃半乳糖和β-(1,3)-D-吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架,交替連接而成的線性硫酸多糖[1]。根據(jù)是否含有3,6內(nèi)醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同,可以將卡拉膠分為十幾種類型,工業(yè)上目前主要使用和生產(chǎn)的有κ-、λ-、ι-三種類型。目前,近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關(guān)工業(yè),其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領(lǐng)域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值而且具有多種生物活性,如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等[2-5]。但由于卡拉膠多糖分子質(zhì)量太大,使得其溶解性差、很難被機(jī)體吸收,嚴(yán)重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。相比卡拉膠多糖,卡拉膠寡糖具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量,其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的化學(xué)方法和物理降解方法反應(yīng)條件不易控制、產(chǎn)物分布不均勻,所以利用反應(yīng)條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點(diǎn)。因此開展對(duì)卡拉膠降解酶的研究具有深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

    迄今為止,研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶,當(dāng)溫度高于60℃時(shí)就會(huì)迅速失活[6]。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),在多個(gè)生物工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛能。熱泉是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境,其溫度一般在50℃以上,有些甚至高于100℃,因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制和新穎的代謝產(chǎn)物。近年來,有關(guān)高溫酶的研究日益廣泛,越來越多具有潛在應(yīng)用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,但有關(guān)高溫卡拉膠酶的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

    本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產(chǎn)卡拉膠酶菌株,初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃,具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,以提高其產(chǎn)酶量及穩(wěn)定性,從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究、酶解特性及工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    1.1.1 菌 種

    產(chǎn)卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣,保存于國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱(-80℃)。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    液體培養(yǎng)基:蛋白胨3g,酵母粉3g,氯化鈉3g,蒸餾水1L;

    固體培養(yǎng)基:蛋白胨3g,酵母粉3g,卡拉膠15g,瓊脂粉15g,氯化鈉3g,蒸餾水1L;

    斜面培養(yǎng)基:蛋白胨5g,酵母粉1g,瓊脂粉15g,氯化鈉3g,蒸餾水1L。

    1.2 方 法

    1.2.1 酶活的測(cè)定-DNS法

    取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物(含0.2%卡拉膠的0.2mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液,pH 9.0)中,70℃反應(yīng)15min,用100℃滅活10min的酶液作對(duì)照;取1mL反應(yīng)物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中,沸水浴中加熱5min,立即冷卻至室溫,定容到25mL,搖勻,于520nm處測(cè)光吸收值;根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)生還原糖的量。1個(gè)酶活力單位(U)定義為:在該條件下,每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖(以 D-半乳糖計(jì))所需要的酶量[7]。

    1.2.2 單因素篩選

    將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基,分別對(duì)接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素變量實(shí)驗(yàn),其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同,每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照用DNS法測(cè)酶活。

    1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)(略)篩選出的4個(gè)顯著性因素,設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn),根據(jù)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入 Design-Expert.V8.0.6軟件中。在 Design-Expert.V8.0.6軟件中進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

    根據(jù)回歸方程及相應(yīng)曲面確定最大值點(diǎn)以及其對(duì)應(yīng)的因素的編碼水平,在該水平下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn),比較實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的差別,驗(yàn)證模型的正確性[8]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對(duì)酶活的影響,結(jié)果表明各種環(huán)境因子對(duì)該菌的生物量(OD600)和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對(duì)生物量和酶活影響的基礎(chǔ)上,初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分(卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L-1、NaCl添加量3‰)(圖1)。

    2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    C源通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了4個(gè)顯著性因素:培養(yǎng)溫度、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(N源)、KCl濃度,設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn),考察了這4個(gè)顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對(duì)這4個(gè)顯著因素的水平設(shè)計(jì)及編碼見表1,Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

    表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box-Behnken test

    表2 N=29的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken test(N=29)

    根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2),以菌株Lc50-1發(fā)酵液酶活(U·mL-1)為響應(yīng)值利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析,得到二次回歸模型:

    Y=8.7098-0.22867A-0.11517B+0.18975C-0.044083D+0.3015AB-1.656AC+0.993AD-0.87775BC+0.06725BD-0.264CD-2.21723A2-1.22298B2-0.64511C2-1.34711D2

    由回歸方差分析(表3)可知:此模型回歸性顯著,回歸模型的R2=93.87%,說明該模型可以解釋93.87%實(shí)驗(yàn)所得菌株Lc 50-1酶活的變化,從而說明該模型與實(shí)際擬合較好,可用于菌株Lc 50-1酶活的分析與預(yù)測(cè),適合菌株Lc 50-1發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

    表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

    2.3 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

    利用Design-Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析得到6個(gè)響應(yīng)面回歸分析圖(圖2~7),可直觀地反映出各因子的變化對(duì)響應(yīng)值影響。

    圖2 Y=(A,B)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.2 Y=(A,B)contour plot and response surface stereogram

    圖3 Y=(A,C)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.3 Y=(A,C)contour plot and response surface stereogram

    圖4 Y=(A,D)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.4 Y=(A,D)contour plot and response surface stereogram

    圖5 Y=(B,C)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 Y=(B,C)contour plot and response surface stereogram

    圖6 Y=(B,D)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Y=(B,D)contour plot and response surface stereogram

    圖7 Y=(C,D)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 Y=(C,D)contour plot and response surface stereogram

    通過Design-Expert軟件進(jìn)一步分析預(yù)測(cè),達(dá)到最高酶活值時(shí),其所對(duì)應(yīng)的A、B、C、D四個(gè)因素的編碼值分別為-0.49、-0.48、1、-0.31,即培養(yǎng)溫度47.5℃(理論值47.45℃)、蛋白胨0.25%(理論值0.248%)、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L-1(由于實(shí)驗(yàn)室具體條件無法達(dá)到一些理論值的精確度,故選取與理論值最接近的值),此時(shí)預(yù)測(cè)最大酶活值為8.904U·mL-1。根據(jù)預(yù)測(cè)的最佳條件進(jìn)行3組發(fā)酵實(shí)驗(yàn),得出的實(shí)際酶活值為:8.883 2U·mL-1、8.824 3U·mL-1、8.921 2U·mL-1,均與預(yù)測(cè)值8.904 1U·mL-1接近,說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)該菌實(shí)際發(fā)酵情況。

    3 討 論

    本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產(chǎn)耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50-1,初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)。以往研究報(bào)道的產(chǎn)卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌[12]、弧菌[13]、噬纖維菌[14]等,而對(duì)芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)產(chǎn)卡拉膠酶的研究尚未見報(bào)道。該研究進(jìn)一步豐富和擴(kuò)大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

    菌株Lc50-1所產(chǎn)的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性,與已報(bào)道的卡拉膠酶[15-17]相比具有明顯優(yōu)勢(shì),有望開發(fā)應(yīng)用于高溫條件的工業(yè)生產(chǎn)中,避免多步反應(yīng)和副反應(yīng)過程,可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

    與傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)相比,響應(yīng)面分析法具有周期短、精度高、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn),不僅能夠評(píng)價(jià)各因素對(duì)生物發(fā)酵過程的影響,并且還能探究幾個(gè)因素的交互作用,得到最佳條件,是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前,響應(yīng)面分析法已在生物技術(shù)的眾多領(lǐng)域,尤其是微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應(yīng)用[8-11]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后所得酶活與預(yù)測(cè)值較為吻合,從而說明該模型設(shè)計(jì)的合理有效性,優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時(shí)提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產(chǎn)量和活力的因素,除菌種外,培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此,選擇適當(dāng)?shù)腃源、N源及金屬離子并對(duì)其組成進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和配制,使其既能滿足產(chǎn)酶微生物生長(zhǎng)的需要,也能滿足菌株產(chǎn)酶的需要。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)卡拉膠酶熱泉菌株Lc50-1的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,有效提高了酶活和產(chǎn)量,從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

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