響應(yīng)面法優(yōu)化熱泉菌Bacillus sp.Lc50－1的發(fā)酵產(chǎn)卡拉膠酶條件＊

胡秋實(shí)，蘇忠亮，何培青，李 江

（1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，青島 山東 266042；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，青島 山東 266061）

卡拉膠是紅藻細(xì)胞壁中的一種親水性多糖，是由重復(fù)的α－（1，4）－D－吡喃半乳糖和β－（1，3）－D－吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架，交替連接而成的線性硫酸多糖［1］。根據(jù)是否含有3，6內(nèi)醚－D－半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同，可以將卡拉膠分為十幾種類型，工業(yè)上目前主要使用和生產(chǎn)的有κ－、λ－、ι－三種類型。目前，近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關(guān)工業(yè)，其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領(lǐng)域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值而且具有多種生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等［2－5］。但由于卡拉膠多糖分子質(zhì)量太大，使得其溶解性差、很難被機(jī)體吸收，嚴(yán)重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。相比卡拉膠多糖，卡拉膠寡糖具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的化學(xué)方法和物理降解方法反應(yīng)條件不易控制、產(chǎn)物分布不均勻，所以利用反應(yīng)條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點(diǎn)。因此開展對(duì)卡拉膠降解酶的研究具有深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶，當(dāng)溫度高于60℃時(shí)就會(huì)迅速失活［6］。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在多個(gè)生物工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛能。熱泉是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，其溫度一般在50℃以上，有些甚至高于100℃，因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制和新穎的代謝產(chǎn)物。近年來，有關(guān)高溫酶的研究日益廣泛，越來越多具有潛在應(yīng)用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，但有關(guān)高溫卡拉膠酶的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產(chǎn)卡拉膠酶菌株，初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃，具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以提高其產(chǎn)酶量及穩(wěn)定性，從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究、酶解特性及工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

產(chǎn)卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣，保存于國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱（－80℃）。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

固體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，卡拉膠15g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L。

1.2 方 法

1.2.1 酶活的測(cè)定－DNS法

取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物（含0.2%卡拉膠的0.2mol·L－1甘氨酸－NaOH緩沖液，pH 9.0）中，70℃反應(yīng)15min，用100℃滅活10min的酶液作對(duì)照；取1mL反應(yīng)物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中，沸水浴中加熱5min，立即冷卻至室溫，定容到25mL，搖勻，于520nm處測(cè)光吸收值；根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)生還原糖的量。1個(gè)酶活力單位（U）定義為：在該條件下，每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖（以 D－半乳糖計(jì)）所需要的酶量［7］。

1.2.2 單因素篩選

將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基，分別對(duì)接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素變量實(shí)驗(yàn)，其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照用DNS法測(cè)酶活。

1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)（略）篩選出的4個(gè)顯著性因素，設(shè)計(jì)Box－Behnken試驗(yàn)，根據(jù)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入 Design－Expert.V8.0.6軟件中。在 Design－Expert.V8.0.6軟件中進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

根據(jù)回歸方程及相應(yīng)曲面確定最大值點(diǎn)以及其對(duì)應(yīng)的因素的編碼水平，在該水平下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，比較實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的差別，驗(yàn)證模型的正確性［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對(duì)酶活的影響，結(jié)果表明各種環(huán)境因子對(duì)該菌的生物量（OD600）和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對(duì)生物量和酶活影響的基礎(chǔ)上，初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分（卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L－1、NaCl添加量3‰）（圖1）。

2.2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

C源通過Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了4個(gè)顯著性因素：培養(yǎng)溫度、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（N源）、KCl濃度，設(shè)計(jì)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)，考察了這4個(gè)顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對(duì)這4個(gè)顯著因素的水平設(shè)計(jì)及編碼見表1，Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box－Behnken test

表2 N＝29的Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box－Behnken test（N＝29）

根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2），以菌株Lc50－1發(fā)酵液酶活（U·mL－1）為響應(yīng)值利用Design－Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸模型：

Y＝8.7098－0.22867A－0.11517B＋0.18975C－0.044083D＋0.3015AB－1.656AC＋0.993AD－0.87775BC＋0.06725BD－0.264CD－2.21723A2－1.22298B2－0.64511C2－1.34711D2

由回歸方差分析（表3）可知：此模型回歸性顯著，回歸模型的R2＝93.87%，說明該模型可以解釋93.87%實(shí)驗(yàn)所得菌株Lc 50－1酶活的變化，從而說明該模型與實(shí)際擬合較好，可用于菌株Lc 50－1酶活的分析與預(yù)測(cè)，適合菌株Lc 50－1發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

2.3 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

利用Design－Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析得到6個(gè)響應(yīng)面回歸分析圖（圖2～7），可直觀地反映出各因子的變化對(duì)響應(yīng)值影響。

圖2 Y＝（A，B）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.2 Y＝（A，B）contour plot and response surface stereogram

圖3 Y＝（A，C）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.3 Y＝（A，C）contour plot and response surface stereogram

圖4 Y＝（A，D）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.4 Y＝（A，D）contour plot and response surface stereogram

圖5 Y＝（B，C）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 Y＝（B，C）contour plot and response surface stereogram

圖6 Y＝（B，D）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Y＝（B，D）contour plot and response surface stereogram

圖7 Y＝（C，D）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 Y＝（C，D）contour plot and response surface stereogram

通過Design－Expert軟件進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)，達(dá)到最高酶活值時(shí)，其所對(duì)應(yīng)的A、B、C、D四個(gè)因素的編碼值分別為－0.49、－0.48、1、－0.31，即培養(yǎng)溫度47.5℃（理論值47.45℃）、蛋白胨0.25%（理論值0.248%）、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L－1（由于實(shí)驗(yàn)室具體條件無法達(dá)到一些理論值的精確度，故選取與理論值最接近的值），此時(shí)預(yù)測(cè)最大酶活值為8.904U·mL－1。根據(jù)預(yù)測(cè)的最佳條件進(jìn)行3組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得出的實(shí)際酶活值為：8.883 2U·mL－1、8.824 3U·mL－1、8.921 2U·mL－1，均與預(yù)測(cè)值8.904 1U·mL－1接近，說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)該菌實(shí)際發(fā)酵情況。

3 討 論

本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產(chǎn)耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50－1，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）。以往研究報(bào)道的產(chǎn)卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌［12］、弧菌［13］、噬纖維菌［14］等，而對(duì)芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）產(chǎn)卡拉膠酶的研究尚未見報(bào)道。該研究進(jìn)一步豐富和擴(kuò)大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

菌株Lc50－1所產(chǎn)的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性，與已報(bào)道的卡拉膠酶［15－17］相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，有望開發(fā)應(yīng)用于高溫條件的工業(yè)生產(chǎn)中，避免多步反應(yīng)和副反應(yīng)過程，可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

與傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)相比，響應(yīng)面分析法具有周期短、精度高、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠評(píng)價(jià)各因素對(duì)生物發(fā)酵過程的影響，并且還能探究幾個(gè)因素的交互作用，得到最佳條件，是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前，響應(yīng)面分析法已在生物技術(shù)的眾多領(lǐng)域，尤其是微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應(yīng)用［8－11］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后所得酶活與預(yù)測(cè)值較為吻合，從而說明該模型設(shè)計(jì)的合理有效性，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時(shí)提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產(chǎn)量和活力的因素，除菌種外，培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此，選擇適當(dāng)?shù)腃源、N源及金屬離子并對(duì)其組成進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和配制，使其既能滿足產(chǎn)酶微生物生長(zhǎng)的需要，也能滿足菌株產(chǎn)酶的需要。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)卡拉膠酶熱泉菌株Lc50－1的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，有效提高了酶活和產(chǎn)量，從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

（References）：

［1］ MCLEAN M W，WILLIAMSON F B.κ－Carrageenase fromPseudomonascarrageenovora［J］.European Joumal of Biochemistry，1979，93：553－558

［2］ YUAN H，SONG J，LI X，et al.Immunomodulation and antitumor activity of kappa－carrageenan oligosaccharides［J］.Cancer Lett，2006，243（2）：228－234.

［3］ HU X K，JIANG X L，AUBREE E，et al.Preparation and invivo antitumor activity of kappa－carrageenan oligosaccharides［J］.Pharmaceutical Biology，2006，44：646－650

［4］ MOU H J，JIANG X L，GUAN H S.Aκ－carrageenan derived oligosaccharide prepared by enzymatic degradation containing antitum or activity［J］.Journal of Applied Phycology，2003，15：297－303

［5］ YAMADA T，OGAMO A，SAITTO T，et al.Preparation an danti－HIV activity of low－molecular－weight carrageenans and their sulfated derivatives［J］.Carbohydrate Polymers，1997，32（1）：51－55.

［6］ TANG Z H，LV J S，ZHANG Z，et al.Screening of marine bacterium producing carrageenan enzyme and its enzymatic properties［J］.

Food Science and Technology，2011，36（6）：18－21.唐志紅，呂家森，張振等.產(chǎn)卡拉膠酶海洋菌株的篩選和酶學(xué)性質(zhì)的初步研究［J］.食品科技，2011，36（6）：18－21.

［7］ GU Y S.Determination methods of enzymatic activities of pectinase as a biologic additive in textile［J］.Textile Sci Res，2002，3：29－35.

［8］ ZHANG T T，SHEN M H.Optimization of culture medium for laccase production fromPycnoporussanguineus（Fr.）Murr.by Plackett－Burman design and response surface methodology［J］.Science and Technology of Food Industry，2011，32（9）：223－227.張?zhí)锾?，沈明?Plackett－Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（9）：223－227.

［9］ SUN W Y，CHEN X，SHI Y，et al.Optimization of fermentation medium of acetic acid by Acetobacter through response surface method［J］.Chemistry ＆Bioengineering，2011，28（1）：37－41.孫文瑛，陳雄，石勇等.響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基［J］.化學(xué)與生物工程，2011，28（1）：37－41.

［10］ ZHOU M F，HUANG P，ZHANG W W.Optimization of fermentation production medium of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae using response surface methodology［J］.Food and Fermentation Technology，2011，47（5）：15－21.周銘鋒，黃璠，張為巍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化谷胱甘肽發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2011，47（5）：15－21.

［11］ WANG H，DENG Z Y，LIU R，et al.Optimization of extraction technology of polysaccharides fromPetasitestricholobusroots by response surface analysis［J］.Food Science，2010，30（2）：46－50.王鴻，鄧澤元，劉蓉，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化山蕗菜根多糖的提取工藝［J］.食品科學(xué)，2010，30（2）：46－50.

［12］ KHAMBHATY Y，MODY K，JHA B，et al.Statistical optimization of medium components forκ－carrageenase production byPseudomonaselongata［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40：813－822.

［13］ ARAKI T，HIGASHIMOTO Y，MORISHITA T.Purification and characterization ofκ－carrageenase from a marine bacteriumVibriosp.CA－1004［J］.Fisheries Science，1999，65（6）：937－942.

［14］ SARWAR G，MATAYOSHI S，ODA H.Purification of a kappa－carrageenase from marineCytophagaspecies［J］.Microbiology and Immunology，1987，31：869－877.

［15］ WANG F F，YAO Z A，WU H G，et al.Optimum cultivation conditions forκ－carrageenanase produced byCellulophagalyticastrainN5－2［J］.China Brewing，2011，（8）：21－25.王飛飛，姚子昂，吳海歌，等.κ－卡拉膠酶海洋CellulophagalyticastrainN5－2的最佳培養(yǎng)條件研究［J］.中國(guó)釀造，2011，（8）：21－25.

［16］ ZHOU M H，MA J S，LI J，et al.Aκ－carrageenase from a newly isolatedpseudoalteromonas－like bacterium，WZUC10［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2008，13（5）：545－551.

［17］ YASMIN K，KALPANA M，JHA B.Purification and characterization ofκ－carrageenase from a novelγ－proteobacterium，Pseudomonaselongata（MTCC 5261）syn.Microbulbiferelongatuscomb.Nov.［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12（6）：668－675.