• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化熱泉菌Bacillus sp.Lc50-1的發(fā)酵產(chǎn)卡拉膠酶條件*

    2014-10-08 12:49:28胡秋實(shí)蘇忠亮何培青
    海洋科學(xué)進(jìn)展 2014年2期
    關(guān)鍵詞:等高線圖卡拉膠面法

    胡秋實(shí),蘇忠亮,何培青,李 江

    (1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,青島 山東 266042;2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所,青島 山東 266061)

    卡拉膠是紅藻細(xì)胞壁中的一種親水性多糖,是由重復(fù)的α-(1,4)-D-吡喃半乳糖和β-(1,3)-D-吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架,交替連接而成的線性硫酸多糖[1]。根據(jù)是否含有3,6內(nèi)醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同,可以將卡拉膠分為十幾種類型,工業(yè)上目前主要使用和生產(chǎn)的有κ-、λ-、ι-三種類型。目前,近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關(guān)工業(yè),其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領(lǐng)域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值而且具有多種生物活性,如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等[2-5]。但由于卡拉膠多糖分子質(zhì)量太大,使得其溶解性差、很難被機(jī)體吸收,嚴(yán)重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。相比卡拉膠多糖,卡拉膠寡糖具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量,其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的化學(xué)方法和物理降解方法反應(yīng)條件不易控制、產(chǎn)物分布不均勻,所以利用反應(yīng)條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點(diǎn)。因此開展對(duì)卡拉膠降解酶的研究具有深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

    迄今為止,研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶,當(dāng)溫度高于60℃時(shí)就會(huì)迅速失活[6]。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),在多個(gè)生物工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛能。熱泉是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境,其溫度一般在50℃以上,有些甚至高于100℃,因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制和新穎的代謝產(chǎn)物。近年來,有關(guān)高溫酶的研究日益廣泛,越來越多具有潛在應(yīng)用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,但有關(guān)高溫卡拉膠酶的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

    本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產(chǎn)卡拉膠酶菌株,初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃,具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,以提高其產(chǎn)酶量及穩(wěn)定性,從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究、酶解特性及工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    1.1.1 菌 種

    產(chǎn)卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣,保存于國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱(-80℃)。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    液體培養(yǎng)基:蛋白胨3g,酵母粉3g,氯化鈉3g,蒸餾水1L;

    固體培養(yǎng)基:蛋白胨3g,酵母粉3g,卡拉膠15g,瓊脂粉15g,氯化鈉3g,蒸餾水1L;

    斜面培養(yǎng)基:蛋白胨5g,酵母粉1g,瓊脂粉15g,氯化鈉3g,蒸餾水1L。

    1.2 方 法

    1.2.1 酶活的測(cè)定-DNS法

    取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物(含0.2%卡拉膠的0.2mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液,pH 9.0)中,70℃反應(yīng)15min,用100℃滅活10min的酶液作對(duì)照;取1mL反應(yīng)物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中,沸水浴中加熱5min,立即冷卻至室溫,定容到25mL,搖勻,于520nm處測(cè)光吸收值;根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)生還原糖的量。1個(gè)酶活力單位(U)定義為:在該條件下,每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖(以 D-半乳糖計(jì))所需要的酶量[7]。

    1.2.2 單因素篩選

    將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基,分別對(duì)接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素變量實(shí)驗(yàn),其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同,每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照用DNS法測(cè)酶活。

    1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)(略)篩選出的4個(gè)顯著性因素,設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn),根據(jù)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入 Design-Expert.V8.0.6軟件中。在 Design-Expert.V8.0.6軟件中進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

    根據(jù)回歸方程及相應(yīng)曲面確定最大值點(diǎn)以及其對(duì)應(yīng)的因素的編碼水平,在該水平下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn),比較實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的差別,驗(yàn)證模型的正確性[8]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對(duì)酶活的影響,結(jié)果表明各種環(huán)境因子對(duì)該菌的生物量(OD600)和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對(duì)生物量和酶活影響的基礎(chǔ)上,初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分(卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L-1、NaCl添加量3‰)(圖1)。

    2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    C源通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了4個(gè)顯著性因素:培養(yǎng)溫度、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(N源)、KCl濃度,設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn),考察了這4個(gè)顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對(duì)這4個(gè)顯著因素的水平設(shè)計(jì)及編碼見表1,Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

    表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box-Behnken test

    表2 N=29的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken test(N=29)

    根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2),以菌株Lc50-1發(fā)酵液酶活(U·mL-1)為響應(yīng)值利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析,得到二次回歸模型:

    Y=8.7098-0.22867A-0.11517B+0.18975C-0.044083D+0.3015AB-1.656AC+0.993AD-0.87775BC+0.06725BD-0.264CD-2.21723A2-1.22298B2-0.64511C2-1.34711D2

    由回歸方差分析(表3)可知:此模型回歸性顯著,回歸模型的R2=93.87%,說明該模型可以解釋93.87%實(shí)驗(yàn)所得菌株Lc 50-1酶活的變化,從而說明該模型與實(shí)際擬合較好,可用于菌株Lc 50-1酶活的分析與預(yù)測(cè),適合菌株Lc 50-1發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

    表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

    2.3 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

    利用Design-Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析得到6個(gè)響應(yīng)面回歸分析圖(圖2~7),可直觀地反映出各因子的變化對(duì)響應(yīng)值影響。

    圖2 Y=(A,B)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.2 Y=(A,B)contour plot and response surface stereogram

    圖3 Y=(A,C)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.3 Y=(A,C)contour plot and response surface stereogram

    圖4 Y=(A,D)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.4 Y=(A,D)contour plot and response surface stereogram

    圖5 Y=(B,C)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 Y=(B,C)contour plot and response surface stereogram

    圖6 Y=(B,D)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Y=(B,D)contour plot and response surface stereogram

    圖7 Y=(C,D)的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 Y=(C,D)contour plot and response surface stereogram

    通過Design-Expert軟件進(jìn)一步分析預(yù)測(cè),達(dá)到最高酶活值時(shí),其所對(duì)應(yīng)的A、B、C、D四個(gè)因素的編碼值分別為-0.49、-0.48、1、-0.31,即培養(yǎng)溫度47.5℃(理論值47.45℃)、蛋白胨0.25%(理論值0.248%)、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L-1(由于實(shí)驗(yàn)室具體條件無法達(dá)到一些理論值的精確度,故選取與理論值最接近的值),此時(shí)預(yù)測(cè)最大酶活值為8.904U·mL-1。根據(jù)預(yù)測(cè)的最佳條件進(jìn)行3組發(fā)酵實(shí)驗(yàn),得出的實(shí)際酶活值為:8.883 2U·mL-1、8.824 3U·mL-1、8.921 2U·mL-1,均與預(yù)測(cè)值8.904 1U·mL-1接近,說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)該菌實(shí)際發(fā)酵情況。

    3 討 論

    本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產(chǎn)耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50-1,初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)。以往研究報(bào)道的產(chǎn)卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌[12]、弧菌[13]、噬纖維菌[14]等,而對(duì)芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)產(chǎn)卡拉膠酶的研究尚未見報(bào)道。該研究進(jìn)一步豐富和擴(kuò)大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

    菌株Lc50-1所產(chǎn)的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性,與已報(bào)道的卡拉膠酶[15-17]相比具有明顯優(yōu)勢(shì),有望開發(fā)應(yīng)用于高溫條件的工業(yè)生產(chǎn)中,避免多步反應(yīng)和副反應(yīng)過程,可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

    與傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)相比,響應(yīng)面分析法具有周期短、精度高、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn),不僅能夠評(píng)價(jià)各因素對(duì)生物發(fā)酵過程的影響,并且還能探究幾個(gè)因素的交互作用,得到最佳條件,是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前,響應(yīng)面分析法已在生物技術(shù)的眾多領(lǐng)域,尤其是微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應(yīng)用[8-11]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后所得酶活與預(yù)測(cè)值較為吻合,從而說明該模型設(shè)計(jì)的合理有效性,優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時(shí)提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產(chǎn)量和活力的因素,除菌種外,培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此,選擇適當(dāng)?shù)腃源、N源及金屬離子并對(duì)其組成進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和配制,使其既能滿足產(chǎn)酶微生物生長(zhǎng)的需要,也能滿足菌株產(chǎn)酶的需要。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)卡拉膠酶熱泉菌株Lc50-1的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,有效提高了酶活和產(chǎn)量,從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

    (References):

    [1] MCLEAN M W,WILLIAMSON F B.κ-Carrageenase fromPseudomonascarrageenovora[J].European Joumal of Biochemistry,1979,93:553-558

    [2] YUAN H,SONG J,LI X,et al.Immunomodulation and antitumor activity of kappa-carrageenan oligosaccharides[J].Cancer Lett,2006,243(2):228-234.

    [3] HU X K,JIANG X L,AUBREE E,et al.Preparation and invivo antitumor activity of kappa-carrageenan oligosaccharides[J].Pharmaceutical Biology,2006,44:646-650

    [4] MOU H J,JIANG X L,GUAN H S.Aκ-carrageenan derived oligosaccharide prepared by enzymatic degradation containing antitum or activity[J].Journal of Applied Phycology,2003,15:297-303

    [5] YAMADA T,OGAMO A,SAITTO T,et al.Preparation an danti-HIV activity of low-molecular-weight carrageenans and their sulfated derivatives[J].Carbohydrate Polymers,1997,32(1):51-55.

    [6] TANG Z H,LV J S,ZHANG Z,et al.Screening of marine bacterium producing carrageenan enzyme and its enzymatic properties[J].

    Food Science and Technology,2011,36(6):18-21.唐志紅,呂家森,張振等.產(chǎn)卡拉膠酶海洋菌株的篩選和酶學(xué)性質(zhì)的初步研究[J].食品科技,2011,36(6):18-21.

    [7] GU Y S.Determination methods of enzymatic activities of pectinase as a biologic additive in textile[J].Textile Sci Res,2002,3:29-35.

    [8] ZHANG T T,SHEN M H.Optimization of culture medium for laccase production fromPycnoporussanguineus(Fr.)Murr.by Plackett-Burman design and response surface methodology[J].Science and Technology of Food Industry,2011,32(9):223-227.張?zhí)锾?,沈明?Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基[J].食品工業(yè)科技,2011,32(9):223-227.

    [9] SUN W Y,CHEN X,SHI Y,et al.Optimization of fermentation medium of acetic acid by Acetobacter through response surface method[J].Chemistry &Bioengineering,2011,28(1):37-41.孫文瑛,陳雄,石勇等.響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基[J].化學(xué)與生物工程,2011,28(1):37-41.

    [10] ZHOU M F,HUANG P,ZHANG W W.Optimization of fermentation production medium of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae using response surface methodology[J].Food and Fermentation Technology,2011,47(5):15-21.周銘鋒,黃璠,張為巍,等.響應(yīng)面法優(yōu)化谷胱甘肽發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2011,47(5):15-21.

    [11] WANG H,DENG Z Y,LIU R,et al.Optimization of extraction technology of polysaccharides fromPetasitestricholobusroots by response surface analysis[J].Food Science,2010,30(2):46-50.王鴻,鄧澤元,劉蓉,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化山蕗菜根多糖的提取工藝[J].食品科學(xué),2010,30(2):46-50.

    [12] KHAMBHATY Y,MODY K,JHA B,et al.Statistical optimization of medium components forκ-carrageenase production byPseudomonaselongata[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,40:813-822.

    [13] ARAKI T,HIGASHIMOTO Y,MORISHITA T.Purification and characterization ofκ-carrageenase from a marine bacteriumVibriosp.CA-1004[J].Fisheries Science,1999,65(6):937-942.

    [14] SARWAR G,MATAYOSHI S,ODA H.Purification of a kappa-carrageenase from marineCytophagaspecies[J].Microbiology and Immunology,1987,31:869-877.

    [15] WANG F F,YAO Z A,WU H G,et al.Optimum cultivation conditions forκ-carrageenanase produced byCellulophagalyticastrainN5-2[J].China Brewing,2011,(8):21-25.王飛飛,姚子昂,吳海歌,等.κ-卡拉膠酶海洋CellulophagalyticastrainN5-2的最佳培養(yǎng)條件研究[J].中國(guó)釀造,2011,(8):21-25.

    [16] ZHOU M H,MA J S,LI J,et al.Aκ-carrageenase from a newly isolatedpseudoalteromonas-like bacterium,WZUC10[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2008,13(5):545-551.

    [17] YASMIN K,KALPANA M,JHA B.Purification and characterization ofκ-carrageenase from a novelγ-proteobacterium,Pseudomonaselongata(MTCC 5261)syn.Microbulbiferelongatuscomb.Nov.[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2007,12(6):668-675.

    猜你喜歡
    等高線圖卡拉膠面法
    高中地理等高線試題解析
    帶參數(shù)時(shí)空分?jǐn)?shù)階Fokas-Lenells 方程的精確解*
    卡拉膠多糖的分子修飾:卡拉膠酶和硫酸化酶的研究進(jìn)展
    什么是卡拉膠?
    卡拉膠酶的來源、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與應(yīng)用研究進(jìn)展
    響應(yīng)面法提取棗皂苷工藝的優(yōu)化
    落葉果樹(2021年6期)2021-02-12 01:29:04
    基于地測(cè)信息管理系統(tǒng)GIS3.2的煤層底板等高線的優(yōu)化
    江西化工(2020年3期)2020-06-29 13:09:56
    響應(yīng)面法優(yōu)化葛黃片提取工藝
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:46
    響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹莓酒發(fā)酵工藝
    基于支持向量機(jī)響應(yīng)面法的連續(xù)剛構(gòu)橋可靠度
    久久国产精品影院| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精华一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜激情福利司机影院| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 午夜精品一区二区三区免费看| 99热这里只有是精品50| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 无限看片的www在线观看| 精品久久久久久久末码| 欧美精品亚洲一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| netflix在线观看网站| 亚洲专区字幕在线| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品亚洲av一区麻豆| 制服人妻中文乱码| 丁香六月欧美| 亚洲一区二区三区不卡视频| 激情在线观看视频在线高清| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av片天天在线观看| 伦理电影免费视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产麻豆成人av免费视频| 在线看三级毛片| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲精品美女久久av网站| 大型黄色视频在线免费观看| 人人妻人人看人人澡| 又爽又黄无遮挡网站| 少妇的丰满在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲午夜理论影院| 曰老女人黄片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色av中文字幕| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜福利18| 国产精品免费一区二区三区在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美极品一区二区三区四区| 两性夫妻黄色片| 床上黄色一级片| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品99久久99久久久不卡| 一级黄色大片毛片| av欧美777| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜日韩欧美国产| e午夜精品久久久久久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产在线精品亚洲第一网站| 悠悠久久av| 国产av一区二区精品久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品国产乱码久久久久久男人| 美女大奶头视频| 18禁观看日本| av天堂在线播放| 日本三级黄在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产单亲对白刺激| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久久免费视频了| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲av片天天在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| videosex国产| 国产一区在线观看成人免费| 精品人妻1区二区| av中文乱码字幕在线| 欧美日韩黄片免| 黄色 视频免费看| 国产精品一区二区精品视频观看| 久热爱精品视频在线9| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av成人精品一区久久| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品久久久久久成人av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲美女视频黄频| 欧美在线黄色| 欧美不卡视频在线免费观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久香蕉精品热| av在线播放免费不卡| 一级片免费观看大全| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美日韩精品网址| 91字幕亚洲| 国产三级中文精品| 国产视频一区二区在线看| 91老司机精品| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产激情欧美一区二区| www.自偷自拍.com| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产亚洲欧美在线一区二区| 宅男免费午夜| 香蕉av资源在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 我要搜黄色片| 成人三级做爰电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费高清视频大片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 精品无人区乱码1区二区| 国产成人av教育| 成人18禁在线播放| 久久久久久人人人人人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品综合一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产不卡一卡二| 大型黄色视频在线免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲自拍偷在线| 国产成人精品无人区| 正在播放国产对白刺激| 好男人电影高清在线观看| 麻豆国产97在线/欧美 | 欧美黄色片欧美黄色片| av中文乱码字幕在线| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品影院6| 久久九九热精品免费| 国产单亲对白刺激| 亚洲中文日韩欧美视频| 在线a可以看的网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本三级黄在线观看| 色av中文字幕| 亚洲色图av天堂| 久久天堂一区二区三区四区| aaaaa片日本免费| 不卡av一区二区三区| 精品久久久久久,| 国产精品av视频在线免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 精品电影一区二区在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲精品在线观看二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 中文字幕高清在线视频| www日本黄色视频网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲专区国产一区二区| 丁香六月欧美| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 国产区一区二久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费在线观看成人毛片| 成人国产综合亚洲| 一区二区三区高清视频在线| 老司机靠b影院| 99热只有精品国产| 欧美性猛交黑人性爽| 老鸭窝网址在线观看| 国产av又大| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 99热6这里只有精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜精品在线福利| 亚洲av成人精品一区久久| 91字幕亚洲| 亚洲国产精品成人综合色| 国产高清videossex| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲成人久久性| 亚洲电影在线观看av| 亚洲国产精品999在线| 国产精品 国内视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色在线成人网| 中国美女看黄片| 校园春色视频在线观看| www.精华液| 精品久久久久久久久久久久久| 国产69精品久久久久777片 | 中国美女看黄片| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久久久久免费高清国产稀缺| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产男靠女视频免费网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久久久久午夜电影| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美三级亚洲精品| 国产精品一及| 老鸭窝网址在线观看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久久国产成人精品二区| 人人妻人人看人人澡| 成人永久免费在线观看视频| 色老头精品视频在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产野战对白在线观看| 99re在线观看精品视频| 亚洲中文av在线| 午夜精品在线福利| 久久久国产成人精品二区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜福利欧美成人| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩高清综合在线| 欧美中文日本在线观看视频| 久久精品国产综合久久久| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产不卡一卡二| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲黑人精品在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 色老头精品视频在线观看| www.自偷自拍.com| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费看日本二区| 久久久久久九九精品二区国产 | 日本成人三级电影网站| av视频在线观看入口| 国产探花在线观看一区二区| 岛国视频午夜一区免费看| 国产v大片淫在线免费观看| www日本在线高清视频| 999久久久国产精品视频| 99re在线观看精品视频| 免费高清视频大片| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄片大片在线免费观看| 国产激情久久老熟女| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久国内视频| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲免费av在线视频| 中文资源天堂在线| 岛国在线观看网站| 18禁观看日本| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 校园春色视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 久久久国产成人免费| 又紧又爽又黄一区二区| www.999成人在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 中文在线观看免费www的网站 | 一a级毛片在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美高清成人免费视频www| 男女下面进入的视频免费午夜| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久久久久久中文| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲国产精品999在线| 视频区欧美日本亚洲| 三级毛片av免费| av免费在线观看网站| 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲男人天堂网一区| 精品久久久久久成人av| 成人三级黄色视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美中文日本在线观看视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 可以在线观看的亚洲视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精华国产精华精| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美日韩黄片免| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美黑人巨大hd| 91麻豆av在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av欧美777| 欧美3d第一页| 最好的美女福利视频网| 久久久久性生活片| 欧美又色又爽又黄视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品影院6| 精品久久久久久久末码| 老司机福利观看| netflix在线观看网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日韩欧美三级三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产高清videossex| 全区人妻精品视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机福利观看| 午夜激情av网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜福利高清视频| 国产高清视频在线观看网站| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲天堂国产精品一区在线| 999久久久精品免费观看国产| 久久亚洲真实| 又紧又爽又黄一区二区| 一本久久中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 99热只有精品国产| 亚洲人与动物交配视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 宅男免费午夜| 色播亚洲综合网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一进一出抽搐动态| 日韩精品青青久久久久久| av福利片在线| 男人舔奶头视频| 一进一出抽搐动态| 午夜视频精品福利| 亚洲五月天丁香| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品电影一区二区在线| 99热只有精品国产| 最近最新免费中文字幕在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一本综合久久免费| 黄色女人牲交| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 91字幕亚洲| 午夜老司机福利片| 亚洲美女黄片视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 91字幕亚洲| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 天天一区二区日本电影三级| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜福利免费观看在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久久久久久午夜电影| 99久久国产精品久久久| 亚洲人成网站高清观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一级毛片女人18水好多| 哪里可以看免费的av片| 国产99久久九九免费精品| 国产三级在线视频| 成人午夜高清在线视频| 欧美一级毛片孕妇| 757午夜福利合集在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲国产精品合色在线| 哪里可以看免费的av片| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 岛国在线观看网站| a在线观看视频网站| 日本黄大片高清| 日本一区二区免费在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 色av中文字幕| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费在线观看日本一区| 嫩草影院精品99| 在线国产一区二区在线| 国产av不卡久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲全国av大片| 又大又爽又粗| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产看品久久| 日韩有码中文字幕| 一二三四在线观看免费中文在| 波多野结衣高清作品| 特大巨黑吊av在线直播| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 美女午夜性视频免费| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲18禁久久av| 日日爽夜夜爽网站| 九色成人免费人妻av| 精品久久久久久久久久久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| av国产免费在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品野战在线观看| 在线观看一区二区三区| 久久久久性生活片| 国产99白浆流出| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人欧美在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 成人国语在线视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品av久久久久免费| 怎么达到女性高潮| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久大精品| 国产乱人伦免费视频| 久久九九热精品免费| 国产一区二区三区视频了| 91国产中文字幕| 欧美精品亚洲一区二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 91老司机精品| 波多野结衣高清无吗| 母亲3免费完整高清在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产精品999在线| 久99久视频精品免费| 小说图片视频综合网站| 丝袜美腿诱惑在线| 人人妻人人看人人澡| 色综合站精品国产| 欧美性长视频在线观看| 一本久久中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 哪里可以看免费的av片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 毛片女人毛片| 日韩欧美精品v在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 成人亚洲精品av一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 在线观看午夜福利视频| 国产乱人伦免费视频| 人成视频在线观看免费观看| 午夜激情av网站| 日韩有码中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| АⅤ资源中文在线天堂| 制服人妻中文乱码| 一a级毛片在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 精品不卡国产一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线播放国产精品三级| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 窝窝影院91人妻| 男女床上黄色一级片免费看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线观看免费视频日本深夜| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产激情欧美一区二区| 亚洲黑人精品在线| 少妇粗大呻吟视频| 女警被强在线播放| 妹子高潮喷水视频| www.www免费av| 特级一级黄色大片| 国产91精品成人一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| av在线天堂中文字幕| 中文字幕久久专区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品 欧美亚洲| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品国产高清国产av| 精品欧美国产一区二区三| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 观看免费一级毛片| 国产黄色小视频在线观看| 日本熟妇午夜| а√天堂www在线а√下载| 91九色精品人成在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲精品在线观看二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 婷婷亚洲欧美| 天天添夜夜摸| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 深夜精品福利| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久大精品| 午夜两性在线视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 99国产精品一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品影院久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品人妻少妇| 国产日本99.免费观看| www.自偷自拍.com| 制服诱惑二区| 小说图片视频综合网站| 中亚洲国语对白在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99热只有精品国产| 成人一区二区视频在线观看| 露出奶头的视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产视频内射| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲最大成人中文| 日韩有码中文字幕| 午夜免费观看网址| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美乱妇无乱码| www日本黄色视频网| 一级毛片高清免费大全| 日本免费a在线| 国产精品国产高清国产av| 一级毛片女人18水好多| 免费av毛片视频| 九色国产91popny在线| 在线免费观看的www视频| 国产高清videossex| 亚洲成人国产一区在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 深夜精品福利| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 深夜精品福利| 精品国产乱子伦一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 色综合婷婷激情| 丝袜美腿诱惑在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99热这里只有精品一区 |