槲皮素對硅肺纖維化大鼠肺組織 TGF-β1、磷酸化 P38MAPK表達(dá)及血清TNF-α水平的影響*

彭海兵，曹福源，王建行，陳 松，趙 霞，劉 燕

1)河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 唐山 063000 2)河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 唐山 063000 3)河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 唐山 063000

硅肺是因長期大量吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵所引起的、以肺組織彌漫性纖維化為主要特征的全身性疾病，是目前我國職業(yè)病中發(fā)病率最高、死亡危險(xiǎn)性較大、對勞動(dòng)者危害最嚴(yán)重的一類。國際勞工組織和WHO共同提出到2030年完全消除硅肺。我國是硅肺大國，硅肺患者數(shù)、接觸粉塵作業(yè)人數(shù)都居世界首位，必須深入開展硅肺的基礎(chǔ)研究，尋求有效控制硅肺的最佳途徑和對策。槲皮素為3，4，5'，3'，4'－五羥基黃酮，是黃酮醇類化合物的典型代表，是分布最廣的植物性黃酮類化合物，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。作者用SiO2誘導(dǎo)制備硅肺纖維化大鼠模型，觀察槲皮素干預(yù)對模型大鼠肺組織 TGF－β1、磷酸化P38MAPK(p－P38MAPK)表達(dá)及血清 TNF－α 水平的影響，為臨床治療硅肺纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠75只，體重190～210 g，由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SiO2粉塵購自中國預(yù)防科學(xué)院勞衛(wèi)所，95%以上顆粒直徑＜5 μm，游離 SiO2＞97%，于180℃恒溫條件下烘烤6 h，用滅菌生理鹽水配成質(zhì)量濃度為50 g/L的懸液，高壓滅菌備用。槲皮素購自Sigma公司，SP免疫組化染色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠 TGF－β1、TNF－α、磷酸化P38MAPK(p－P38MAPK)單克隆抗體及羊抗兔 IgG購自Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將75只大鼠稱重、編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即對照組、模型組、槲皮素組，每組25只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組與槲皮素組大鼠采用非暴露法氣管內(nèi)一次性注入SiO2懸液(250 mg/kg)制備硅肺纖維化模型，對照組以同樣方法注入生理鹽水0.2～0.3 mL;自次日開始，對照組和模型組大鼠每天腹腔注射0.5 mL生理鹽水，槲皮素組每天按50 mg/kg劑量腹腔注射槲皮素，連續(xù)14 d。

1.3 標(biāo)本制備 在造模后的第3、7、14、21、28天，每組分別取5只大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉后，用采血管從腹主動(dòng)脈取全血標(biāo)本，用于血清TNF－α水平的測定;采血后處死大鼠，切取右肺中葉組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片處理，用于肺組織形態(tài)學(xué)(HE染色)觀察和TGF－β1蛋白的檢測;取右肺上葉組織進(jìn)行p－P38MAPK蛋白檢測。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 血清TNF－α水平的測定 全血標(biāo)本獲取后靜置3～5 min，2300 r/min離心10 min，留取上清液－20℃凍存。采用ELISA法測定血清TNF－α水平，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.4.2 肺組織TGF－β1蛋白的檢測 應(yīng)用免疫組化SP法檢測肺組織TGF－β1蛋白的表達(dá)，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。將 TGF－β1抗體稀釋100倍。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封固。用PBS代替一抗作陰性對照。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質(zhì)為陽性細(xì)胞。染色后切片用北京航空航天大學(xué)圖像分析系統(tǒng)及Image－proplus專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和分析。每張切片內(nèi)選擇6個(gè)400倍視野，測量每個(gè)視野內(nèi)TGF－β1陽性區(qū)域積分光密度值，取6個(gè)視野的均值作為該只大鼠肺組織TGF－β1蛋白的表達(dá)水平。

1.4.3 肺組織p－P38MAPK的檢測 取大鼠右肺上葉組織80 mg，加新鮮配制的組織裂解液完全裂解后，于4℃條件下，12000 r/min離心10 min，收集上清。用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，取總蛋白，以120 μg/孔上樣進(jìn)行 SDS－PAGE 電泳，2 h 后電轉(zhuǎn)移(180 mA，1.5 h)于NC膜上，體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，PBST漂洗，加兔抗大鼠 p－P38MAPK抗體(稀釋500倍)4℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋500倍)37℃孵育60 min，顯色劑顯色，有清晰條帶出現(xiàn)即用雙蒸水終止顯色。用掃描儀對NC膜上蛋白條帶進(jìn)行圖像掃描，用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。以GAPDH為內(nèi)對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。同一時(shí)間點(diǎn)3組大鼠血清TNF－α水平、肺組織TGF－β1和p－P38MAPK蛋白表達(dá)水平的比較，同組不同時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)的比較均采用單因素方差分析和LSD－t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化 見圖1。模型組大鼠一次性注入SiO2懸液后第7天，肺組織為明顯的急性炎癥表現(xiàn)，第14和28天肺組織炎癥較前有所減輕，肺間質(zhì)增多，肺泡間隔以及部分肺泡腔被膠原和纖維蛋白占據(jù)，間質(zhì)內(nèi)由炎性細(xì)胞逐漸向以淋巴細(xì)胞浸潤為主過渡。槲皮素組肺組織病理變化與模型組相似，但早期肺組織炎癥反應(yīng)和晚期纖維化程度都輕于模型組。

2.2 3組大鼠血清 TNF-α水平的比較 見表1。模型組和槲皮素組大鼠血清TNF－α水平均在造模后第7天達(dá)高峰，之后逐漸下降。各時(shí)間點(diǎn)模型組和槲皮素組大鼠血清TNF－α水平均較對照組明顯升高，但槲皮素組低于模型組。

圖1 3組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

表1 3組大鼠血清TNF-α水平的比較 μg/L

2.3 3組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)的比較 見圖2、表2。

圖2 3組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表2 3組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 3組大鼠肺組織p-P38MAPK表達(dá)的比較 見表3。

表3 3組大鼠肺組織p-P38MAPK表達(dá)水平的比較

3 討論

硅肺發(fā)生發(fā)展過程是炎癥反應(yīng)與纖維化相互交織進(jìn)行的過程，涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)體系，早期以炎癥反應(yīng)為主，當(dāng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)體系中致纖維化細(xì)胞因子占優(yōu)勢時(shí)，將導(dǎo)致肺纖維化的形成。TGF－β1和 TNF－α被認(rèn)為是兩個(gè)關(guān)鍵性致纖維化因子[1]。肺泡巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)TGF－β1，TGF－β1 對細(xì)胞的增殖和分化具有廣泛的調(diào)控功能，參與組織的修復(fù)和纖維化[2－3]。TNF－α 由肺泡巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，能與兩種細(xì)胞膜相關(guān)受體結(jié)合而發(fā)揮作用，是前炎癥細(xì)胞因子。第十七次全國職業(yè)病學(xué)術(shù)交流會(huì)提出TNF－α在塵粒尤其是石英介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺纖維化的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，而特異性抗TNF－α抗體可改善 SiO2介導(dǎo)的肺纖維化。P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員之一，可因紫外線、細(xì)胞因子、熱休克和內(nèi)毒素的作用而激活，激活后可促進(jìn) TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8等多種促炎因子的表達(dá)和釋放，使炎癥反應(yīng)調(diào)控失衡，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)“瀑布”效應(yīng)[4－5]。Morales 等[6]發(fā)現(xiàn)TGF－β1表達(dá)也需要 P38MAPK信號(hào)通路的激活。Chen等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P38MAPK信號(hào)通路在人肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化方面起著重要作用。近年有研究[8－9]報(bào)道 P38MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了肝臟纖維化、肺臟纖維化與心臟纖維化等多種器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

槲皮素是膳食中最常見的類黃酮化合物之一，屬類黃酮化合物中的黃酮醇。蔥、蘋果、茶葉中含有較為豐富的槲皮素。Kleemann等[10]的研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗增生、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種功能。Hernández－Ortega 等[11]的研究表明，槲皮素可以減少肝星狀細(xì)胞TGF－β1的表達(dá)，從而抑制肝纖維化的發(fā)展。彭海兵等[12]的研究證實(shí)，槲皮素可以減少人胚肺成纖維細(xì)胞TGF－β1的表達(dá)。

此次實(shí)驗(yàn)中，作者觀察到:模型組大鼠一次性注入SiO2懸液后第7天，肺組織為明顯的急性炎癥期表現(xiàn)，肺泡腔、肺間質(zhì)內(nèi)有大量的多核及單核細(xì)胞浸潤，伴有水腫和毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，病變嚴(yán)重區(qū)肺泡正常結(jié)構(gòu)被炎性肉芽組織破壞;第14天肺組織炎癥反應(yīng)較前有所減輕，但仍有出血及水腫，成纖維細(xì)胞增多，肺間隔明顯增寬，有膠原沉積及斑片狀的纖維化改變;第28天肺組織炎癥反應(yīng)較前略有減輕，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔明顯變小，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)增多，大量膠原沉積在新生的毛細(xì)血管周圍，肺泡間隔以及部分肺泡腔被膠原和纖維蛋白占據(jù)，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞逐漸向以淋巴細(xì)胞浸潤為主過渡。槲皮素組肺組織病理變化與模型組相似，但早期肺組織炎癥反應(yīng)程度和晚期纖維化程度都輕于模型組，說明槲皮素抑制了SiO2誘導(dǎo)的大鼠肺組織纖維化的過程。進(jìn)一步的檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組和槲皮素組大鼠血清TNF－α水平、肺組織TGF－β1和p－P38MAPK蛋白表達(dá)水平均升高，但槲皮素組大鼠血清 TNF－α水平 和肺組 織 TGF－β1、p－P38MAPK表達(dá)水平均低于模型組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素可能通過抑制P38MAPK信號(hào)通路的激活，減少TGF－β1和TNF－α生成，從而抑制SiO2誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化過程。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為槲皮素的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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