原發(fā)性肝細(xì)胞癌血管生成擬態(tài)觀察中PAS染色法的應(yīng)用*

劉 彪，林麗琳，翁劍武，吳志峰，王 鳳，謝 群

莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室 莆田351100

自從Maniotis 等［1］在對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究中發(fā)現(xiàn)并提出了血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)之后，高侵襲性惡性腫瘤VM 成為研究熱點(diǎn)。VM 指瘤細(xì)胞圍繞形成的管狀結(jié)構(gòu)，且管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部伴有血漿和紅細(xì)胞，其對(duì)評(píng)價(jià)腫瘤療效和患者預(yù)后有重要價(jià)值［2］。VM 主要通過(guò)過(guò)碘酸-希夫(periodic acid-schiff staining，PAS)染色并結(jié)合CD34 等血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記分子來(lái)確定。然而，PAS 染色過(guò)程中存在染色淺、層次不分明、假陽(yáng)性等問(wèn)題，給VM 的觀察與鑒別造成了困擾。作者在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)VM 的研究中發(fā)現(xiàn)，組織切片厚度、孵育溫度、染色及閱片等環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響至關(guān)重要。為此，作者總結(jié)了相應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施，為正確使用PAS 染色提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 主要材料與試劑 采用莆田學(xué)院附屬醫(yī)院病理科保存完整的HCC 石蠟標(biāo)本制作病理切片。PAS 試劑盒購(gòu)自羅基(北京)生物技術(shù)有限公司;CD34 抗體、SP 染色試劑盒及DAB 試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1．2 切片制備與CD34-PAS 雙染 標(biāo)本在切片前置于－20℃冰箱中冷凍15～20 min，制備厚度分別為2 和3 μm 的切片。切片自然干燥后于65℃烤箱中烘烤120 min，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，用過(guò)氧化物酶阻斷山羊血清封閉后滴加CD34 抗體工作液，置濕盒于4℃孵育過(guò)夜，滴加二抗孵育20 min，DAB顯影，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞著色后終止顯色反應(yīng)。將切片置于10 g/L 高碘酸(A 液)中氧化5 min，蒸餾水沖洗3次后加入Schiff 溶液(B 液)避光孵育15 min，流水沖洗10 min 后加入Little-Mayer 蘇木素(C液)染色4 min，蒸餾水浸洗后加入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇(D 液)，待組織顏色變紅立即終止分化，流水沖洗15 min 后用蒸餾水浸洗3次，逆濃度梯度乙醇脫水、二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片。

1．3 結(jié)果判定 鏡下CD34 染色陽(yáng)性表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色著色，PAS 染色陽(yáng)性表現(xiàn)為管腔基底膜呈紫紅色著色。若觀察到由肝癌細(xì)胞呈梁狀排列構(gòu)成的網(wǎng)狀血管通道，腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，血細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間有呈櫻桃紅色的PAS 陽(yáng)性的基底膜樣結(jié)構(gòu)，且CD34 陰性，即判定為VM;若管壁有CD34 陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞和PAS 陽(yáng)性結(jié)構(gòu)，無(wú)論腔內(nèi)有無(wú)紅細(xì)胞均判定為內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管。

2 結(jié)果

2．1 內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管的形態(tài)特點(diǎn) HCC組織中肝血竇出現(xiàn)毛細(xì)血管化，內(nèi)皮細(xì)胞CD34 陽(yáng)性，內(nèi)皮細(xì)胞下方也出現(xiàn)PAS 陽(yáng)性的基底膜，說(shuō)明HCC組織中存在CD34-PAS 雙陽(yáng)性血管，判定為內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管(圖1)。

2．2 VM 的形態(tài)特點(diǎn) 采用3 μm 厚的切片及上述優(yōu)化的染色步驟進(jìn)行CD34-PAS 雙染，VM 結(jié)構(gòu)的PAS 染色顯色深淺合適，對(duì)比度強(qiáng)，鏡下辨析度高。HCC組織中VM 主要呈現(xiàn)兩種形態(tài):由CD34 陰性的肝癌細(xì)胞構(gòu)成擬態(tài)管腔，一層薄厚不均的PAS 陽(yáng)性基底膜將腫瘤細(xì)胞和管腔內(nèi)的紅細(xì)胞分開(kāi)，這種稱為腫瘤細(xì)胞型VM(圖1C);若管腔主體結(jié)構(gòu)是PAS 陽(yáng)性的基底膜而不是腫瘤細(xì)胞，則稱之為細(xì)胞外基質(zhì)型VM(圖1D)。但是如果采用2 μm 厚的切片，則PAS 胞漿染色結(jié)果呈淺粉偏白，細(xì)胞邊緣櫻桃紅色略明顯(圖1E)，不利于鏡下觀察。

圖1 HCC組織中內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管和VM 的形態(tài)(CD34-PAS 雙染法，×400)

2．3 容易與VM 混淆的病變結(jié)構(gòu)的形態(tài)特點(diǎn)HCC組織中肝細(xì)胞常伴有透明細(xì)胞型及假腺樣結(jié)構(gòu)等多種病變，易與VM 混淆。透明細(xì)胞型的肝癌細(xì)胞體積大，胞質(zhì)可呈淡染細(xì)絲狀或透明空泡樣，PAS 染色亦呈陽(yáng)性(圖2A);假腺樣結(jié)構(gòu)可見(jiàn)癌細(xì)胞呈單層立方上皮樣圍成類似甲狀腺濾泡樣的結(jié)構(gòu)(圖2B)。

圖2 HCC 中其他病變結(jié)構(gòu)的形態(tài)(CD34-PAS 雙染法，×400)

3 討論

近年來(lái)，腫瘤微循環(huán)研究中常應(yīng)用CD34-PAS雙染法來(lái)判定內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管和VM 等結(jié)構(gòu)。作者應(yīng)用此方法對(duì)HCC組織進(jìn)行染色觀察，對(duì)應(yīng)用過(guò)程中的注意事項(xiàng)進(jìn)行了總結(jié)。

3．1 試劑的保存和使用 實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)，Schiff試劑現(xiàn)配使用效果較佳，但配制步驟繁復(fù)，保存時(shí)間較短，一般采用PAS 試劑盒。即使將Schiff 試劑4℃避光保存仍易失效，故作者采用－20℃避光分裝保存，使用前恢復(fù)至室溫，避免反復(fù)凍融和開(kāi)啟影響染色效果。正常的Schiff 試劑打開(kāi)時(shí)有明顯氣味，反之則失效［3］。若失效，每10 mL 溶液中加入0．108 g偏重亞硫酸鈉仍可使用［4］。

3．2 切片制備 通常一個(gè)肝癌細(xì)胞的直徑約為6 μm，SP 法染色中一般采用2 μm 厚切片，以防止細(xì)胞重疊不利于鏡下觀察。但作者發(fā)現(xiàn)，2 μm 厚的切片PAS 胞質(zhì)染色淺粉偏白，細(xì)胞邊緣櫻桃紅略明顯，不利于鏡下觀察，故在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)采用同一組織塊的連續(xù)切片，對(duì)比了染色效果，最終發(fā)現(xiàn)3 μm 厚的切片染色效果較佳。

3．3 染色過(guò)程中的注意事項(xiàng) 作者發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室室溫直接影響PAS 染色效果。Schiff 試劑的最佳反應(yīng)溫度在26℃以上，將冷凍的試劑取出后須避光恢復(fù)至室溫后方可使用。冬季則可將濕盒放置于調(diào)好溫度的恒溫箱里，既能保溫，又能避光。PAS 試劑盒中的A、B 液滴加到組織塊時(shí)會(huì)局限于組織塊邊緣，無(wú)法擴(kuò)開(kāi)，易造成邊緣淡染。雖然作為去垢劑的Tween-20 具有表面擴(kuò)張力的作用，加入洗液中可擴(kuò)開(kāi)液面，但是作者發(fā)現(xiàn)Tween-20 會(huì)淡化陽(yáng)性的櫻桃紅染色，故不建議使用。適當(dāng)增加試劑用量，可使擴(kuò)大的液滴緩慢覆蓋住組織邊緣，從而改善最終染色結(jié)果。

3．4 重視假陽(yáng)性染色 PAS 染色過(guò)程易出現(xiàn)假陽(yáng)性而造成誤判。過(guò)碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，它能氧化糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1，2-乙二醇基或者多糖分子的去氫葡萄糖殘基，使之變?yōu)槎?，醛再與Schiff 試劑結(jié)合，形成一種紫紅色的品紅化合物。同時(shí)過(guò)碘酸還可將細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)氧化，從而出現(xiàn)干擾性的假陽(yáng)性染色。因此，使用過(guò)程中應(yīng)注意選擇好過(guò)碘酸的濃度及氧化時(shí)間。作者發(fā)現(xiàn)，采用10 g/L 過(guò)碘酸進(jìn)行染色并將時(shí)間控制在5 min，假陽(yáng)性染色控制較好，超過(guò)10 min 則容易出現(xiàn)假陽(yáng)性［5］。實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照，即省去滴加Schiff 試劑這一步驟，可以驗(yàn)證組織中是否有可見(jiàn)糖原，從而排除假陽(yáng)性。

3．5 VM 結(jié)構(gòu)的辨析 閱片并對(duì)VM 結(jié)構(gòu)進(jìn)行辨析是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。判定腫瘤細(xì)胞型VM 的要點(diǎn)是管壁結(jié)構(gòu)為肝癌細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞［6］，一般HE染色病理學(xué)觀察即能確定，也可以進(jìn)一步行Hepatocyte 染色確定是否為肝癌細(xì)胞。PAS 陽(yáng)性的基底膜是重要的判定依據(jù)之一，但有時(shí)PAS 陽(yáng)性物質(zhì)可能會(huì)不連續(xù)［7］。透明細(xì)胞型病變結(jié)構(gòu)易與VM 相混淆，但該結(jié)構(gòu)的外周不會(huì)出現(xiàn)肝癌細(xì)胞環(huán)繞排列，且透明區(qū)域不會(huì)出現(xiàn)紅細(xì)胞;假腺樣結(jié)構(gòu)在鏡下除類似甲狀腺濾泡樣的結(jié)構(gòu)外，腔內(nèi)常出現(xiàn)PAS 陽(yáng)性的膽汁;上述特點(diǎn)可用于VM 與其他病變結(jié)構(gòu)的區(qū)別。

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