HSP70、JNK和p38在放線菌素D誘導(dǎo)的A549細胞凋亡中的作用*

王小龍，馮斐斐，孫鵬輝，李 杰，陸?zhàn)┤?，闕菡雅，徐小艷，姚 武，周 舫#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)漯河市疾病預(yù)防控制中心應(yīng)急辦公室 漯河 462300 3)廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生與地方病防制所 南寧 530028

肺癌是目前對人類危害最大的惡性腫瘤。近幾十年來，其發(fā)病率和病死率都急劇上升，居世界癌癥死因之首。目前，肺癌的治療仍然以放化療為主，關(guān)于肺癌治療的研究也多集中于此。然而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來不斷有新的肺癌療法出現(xiàn)，如免疫療法、基因療法等[1]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是熱休克蛋白家族的一個重要成員，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。有研究[3]證實，HSP70在腫瘤細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)參與調(diào)控細胞凋亡過程，而Caspase-3是細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者[4-6]。作者采用放線菌素D(actinomycin D，Act D)誘導(dǎo)人肺腺癌細胞株A549細胞凋亡，分別用熱處理、JNK和p38 MAPK通路抑制劑作用于Act D誘導(dǎo)過的A549細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的變化，Western blot檢測細胞中HSP70、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化p38(p-p38)和Caspase-3的表達水平，探討 HSP70、JNK和 p38在 Act D誘導(dǎo)的A549細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 A549細胞由中科院上海細胞生物研究所提供。蛋白抽提試劑盒，eECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，Act D(北京Solarbio公司)，Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)，Nanovue plus微量蛋白核酸測定儀(美國GE公司)。

1.2 Act D染毒劑量的MTT法確定 將對數(shù)生長期的細胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔200 μL，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境下孵育至鋪滿孔底。分別加入終質(zhì)量濃度為 0、5、10、20、40、60、80、160 mg/L 的Act D，每組設(shè)5個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入20 μL的MTT(5 g/L)染液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，每孔加入 100 μL DMSO，室溫搖晃 10 min，在 492 nm處檢測吸光度，計算細胞致死率，根據(jù)MTT的結(jié)果選定所用的染毒濃度。

1.3 各組細胞凋亡率的流式細胞術(shù)檢測 采用Act D作為染毒物，將對數(shù)生長期的細胞分為DMSO對照組(A組)、Act D染毒組(B組)、熱處理(42℃，30 min)+Act D組(C組)、JNK抑制劑SP600125+Act D組(D組)和p38 MAPK抑制劑SB203580+Act D組(E組)5組。各組細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，重懸，1000 r/min離心10 min，使用工作液200 μL重懸細胞于1.5 mL的EP管中，然后向各管中分別加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL，混勻后避光反應(yīng)10 min上機檢測。每組均設(shè)6個平行對照。

1.4 各組細胞中蛋白含量的Western blot法測定細胞培養(yǎng)及分組同1.3。使用蛋白抽提試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用Nanovue plus微量蛋白核酸測定儀測定蛋白濃度，調(diào)整濃度，確保每孔上樣量均為50 μg。將蛋白樣品和上樣緩沖液按比例混勻，100℃，5 min變性。與標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白Marker同時上樣，電泳條件為80 V 40 min，120 V 90 min。電泳結(jié)束后切膠，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用50 g/L的脫脂牛奶封閉2 h，使用TBST溶液洗脫3次，10 min/次，然后用一抗(抗體均購自北京博奧森生物公司，按1∶500稀釋)4℃孵育過夜，二抗(按1∶2000稀釋)常溫孵育3 h以上，洗脫3次后，在暗室中進行eECL顯影。用圖像分析軟件Quantity one分析條帶的積分光密度。每組均設(shè)3個平行對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進行分析。應(yīng)用方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞凋亡率、HSP70、p-JNK、p-p38以及Caspase-3表達水平的差異，檢驗水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗染毒劑量的MTT法確定 MTT實驗結(jié)果顯示，隨著Act D濃度的提高，A549細胞的致死率逐漸上升，Act D對A549細胞的半數(shù)致死濃度大約為75 mg/L，該實驗選用20 mg/L作為染毒劑量。

2.2 各組細胞凋亡率以及 HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3的表達水平 見表1、圖1。

表1 各組細胞凋亡率以及HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3的表達水平

圖1 Western blot檢測HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3表達水平

3 討論

HSP70可由多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生，如應(yīng)激、藥物、腫瘤等。JNK和p38 MAPK作為MAPK超家族的重要成員，對細胞生存具有重要意義[4]。研究[7-9]證實，HSP70參與調(diào)控細胞凋亡過程，且該過程很可能與JNK和p38 MAPK通路有關(guān)。

為探討HSP70、JNK和p38 MAPK在Act D誘導(dǎo)的A549細胞凋亡中的作用，作者分別采用熱處理、JNK抑制劑SP600125和p38 MAPK抑制劑SB203580處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Act D組相比，以上3個處理組的細胞凋亡率明顯下降。Western blot結(jié)果也進一步證明，經(jīng)過Act D處理的A549細胞HSP70表達增加，而熱處理、SP600125和SB203580能夠降低Act D對A549細胞的作用效果，說明HSP70可能通過JNK和p38 MAPK通路來抑制細胞的凋亡過程。Gong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可能與MK2的磷酸化有關(guān)，而MK2參與了p38 MAPK通路磷酸化。由此可見，HSP70參與了細胞的增殖和凋亡過程，而這一過程涉及JNK或p38 MAPK的激活。徐勇等[10]用JNK和p38抑制劑作用于Jurkat細胞，發(fā)現(xiàn)2種抑制劑能夠降低藤黃酸誘導(dǎo)的Caspase-3水平。

然而細胞凋亡涉及多個通路，目前已知的有線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等[11]。HSP70可能同時與多個細胞信號通路共同參與細胞凋亡的調(diào)控，具體的機制還需進一步研究予以證實。

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