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    KLK14基因沉默對(duì)OVCAR-3細(xì)胞凋亡和遷移能力的影響*

    2014-10-08 09:06:10張瑞濤史惠蓉陳志敏賈艷艷
    關(guān)鍵詞:卵巢癌試劑盒引物

    張瑞濤,史惠蓉,任 芳,陳志敏,賈艷艷,馮 巍

    鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

    人組織激肽釋放酶(kallikrein-related peptidase,KLK)家族包含15種結(jié)構(gòu)同源的絲氨酸激酶,其基因定位于染色體19q13.4,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織重構(gòu)等一系列生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2]。KLK14又稱(chēng)類(lèi)組織激肽釋放酶6,具有胰島素樣和糜蛋白酶樣雙重作用,能降解膠原Ⅳ等細(xì)胞外基質(zhì),可能與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)等有關(guān)[3]。研究[4]表明,KLK14在卵巢癌和乳癌等多種上皮性腫瘤組織中異常高表達(dá)。作者采用RNA干擾技術(shù)抑制KLK14在人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá),觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡和遷移的影響,初步探討KLK14與卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系及可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞和試劑 人卵巢癌 SK-OV-3、OVCAR-3和HO-8910細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,預(yù)實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)KLK14基因和蛋白在OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá)均高于SK-OV-3和 HO-8910細(xì)胞,故選用OVCAR-3細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。cDNA第一鏈合成試劑盒為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品,2×Taq Master Mix為上海萊楓生物公司產(chǎn)品。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物序列,交上海生物工程公司合成。TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司,8 μm Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。KLK14 shRNA質(zhì)粒、control shRNA質(zhì)粒、Transfection Reagent、山羊抗人KLK14多克隆抗體、鼠抗人MMP2單克隆抗體和鼠抗人MMP9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。鼠抗人β-actin、鼠抗人Caspase-3和鼠抗人Caspase-9單克隆抗體、IP及WB蛋白提取液、ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 OVCAR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按照Transfection Reagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 d,換取不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基后調(diào)整OVCAR-3細(xì)胞密度為2×105mL-1,以每孔2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞50% ~70%融合時(shí),分為3組,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組更換為新鮮配制的含KLK14 shRNA或?qū)φ誷hRNA的無(wú)抗生素、無(wú)血清培養(yǎng)基,空白組僅加入同種培養(yǎng)基。孵育6 h后加入體積分?jǐn)?shù)20%的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)18~24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 RT-PCR Trizol提取細(xì)胞總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。KLK14上游引物 5'-ACGCACCCCAACTA CAACTC-3',下游引物 5'-GAACTCCTGCACAGAC CATG-3'(283 bp);β-actin上游引物 5'-ACGCAC CCCAACTACAACTC-3',下游引物 5'-TCTCCTTAAT GTCACGCACGA-3'(372 bp)。PCR反應(yīng)體系:模板cDNA 1 μL,2 × Taq Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各 1 μL,無(wú) RNase H2O 定容至 25 μL。RT-PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠(混有EB)電泳,Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)采集、分析圖像,以KLK14/β-actin比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 TUNEL實(shí)驗(yàn) 在載玻片上滴加單細(xì)胞懸液,培養(yǎng)4~6 h至細(xì)胞貼壁后,以40 g/L多聚甲醛固定30 min,體積分?jǐn)?shù)0.3%過(guò)氧化氫甲醇阻斷30 min,體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100孵育2 min,然后按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞,DAB染色后封片,高倍鏡下選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)目,取均數(shù),計(jì)算凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度至5×104mL-1,每組設(shè)3個(gè)孔,Transwell小室上室加入細(xì)胞懸液,200 μL/孔,下室加入含體積分?jǐn)?shù)20%血清的培養(yǎng)基,500 μL/孔,培養(yǎng)6 h后甲醇固定5 min,蘇木素染色30 min。擦去上室細(xì)胞后倒置小室,倒置顯微鏡下選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞后取均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6 Western blot 收集細(xì)胞,IP及WB蛋白提取液提取細(xì)胞總蛋白,各取40 μg總蛋白進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE電泳,20 V恒壓半干轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含50 g/L脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過(guò)夜,分別用KLK14抗體(按 1∶500稀釋)、β-actin抗體(按1∶400稀釋)、Caspase-3(按1∶500稀釋)、Caspase-9(按1∶1000稀釋)、MMP2(按1∶600稀釋)和MMP9(按1∶600稀釋)室溫孵育1.5 h。二抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)IgG(按1∶5000稀釋),室溫孵育1.5 h,ECL發(fā)光試劑盒處理后曝光。Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)采集、分析圖像,以目的蛋白/β-actin的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞中KLK14 mRNA與蛋白及 Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的差異以及細(xì)胞凋亡率和遷移細(xì)胞數(shù)的差異,組間兩兩比較采用 Bonferroni檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 3組細(xì)胞中KLK14 mRNA和蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1、表1。

    2.2 3組細(xì)胞凋亡率比較 空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3細(xì)胞的凋亡率分別為(4.7±2.1)%、(7.3 ±2.1)%和(30.3 ±2.9)%,實(shí)驗(yàn)組 OVCAR-3細(xì)胞的凋亡率明顯高于其他2組細(xì)胞(F=54.313,P <0.001),見(jiàn)圖2。

    圖1 3組細(xì)胞中KLK14 mRNA和蛋白的表達(dá)

    表1 3組OVCAR-3細(xì)胞中KLK14 mRNA及蛋白的表達(dá)

    2.3 3組細(xì)胞遷移能力比較 空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OVCAR-3遷移細(xì)胞數(shù)分別為(67.7±2.5)、(66.0 ±5.3)和(29.7 ±3.8)個(gè),實(shí)驗(yàn)組 OVCAR-3細(xì)胞遷移能力低于其他2組(F=85.283,P=0.013),見(jiàn)圖3。

    2.4 3 組細(xì)胞中 Caspase-3、Caspase-9、MMP2 和MMP9蛋白的表達(dá)比較 見(jiàn)圖4、表2。

    圖2 3組細(xì)胞的凋亡情況(DAB,×400)

    圖3 3組細(xì)胞的遷移情況(蘇木素,×400)

    圖4 3組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)

    表2 3組OVCAR-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和 MMP9蛋白的表達(dá)

    3 討論

    卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近年來(lái)其死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤之首[5]。作者所在的課題組的前期研究[6-7]顯示,卵巢上皮性癌組織中存在KLK14的高表達(dá),KLK14的異常表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。KLK14基因在多種惡性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中存在異常表達(dá),例如乳腺、卵巢、前列腺、睪丸、肺、結(jié)腸、唾液腺等部位的惡性腫瘤組織,并與相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及疾病的預(yù)后有密切關(guān)系[8-14]。

    在惡性腫瘤的發(fā)病中抵抗程序性細(xì)胞死亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的激活是大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞生理學(xué)特點(diǎn)的重要共性改變[15]。目前,KLK14基因與卵巢癌細(xì)胞凋亡和遷移的關(guān)系尚不清楚。

    該研究中作者采用KLK14shRNA轉(zhuǎn)染OVCAR-3細(xì)胞后,OVCAR-3細(xì)胞中 KLK14 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低,細(xì)胞凋亡率升高,遷移能力受抑。此外,該研究結(jié)果還顯示,轉(zhuǎn)染KLK14 shRNA的OVCAR-3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因caspase-3和caspase-9的表達(dá)明顯增加,與細(xì)胞侵襲和遷移性能相關(guān)的MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)明顯降低。上述結(jié)果亦印證了下調(diào)KLK14表達(dá)可抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的惡性行為。

    綜上所述,KLK14基因受到抑制后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的遷移能力;KLK14可作為卵巢癌治療干預(yù)的目標(biāo)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究KLK14基因與卵巢癌的關(guān)系,有助于進(jìn)一步闡明卵巢癌發(fā)病的分子機(jī)制,從而為卵巢癌的治療干預(yù)提供新的分子生物學(xué)靶點(diǎn)。

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