熱療對胃癌細胞株化療敏感性的影響

李芳 孔凡志 李旭忠 周聯(lián)明 張光軍 黃忠明 何以豐 張學(xué)利

(1.蘇州大學(xué)研究生院，江蘇蘇州 215006;2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院普外科，上海 201400;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200127)

化療是晚期胃癌的治療手段之一，然而，多藥耐藥常導(dǎo)致化療療效降低甚至失敗。為了克服化療耐藥的問題，抗腫瘤藥物常與其他治療方法(如熱療)聯(lián)合應(yīng)用。據(jù)報道，熱療在晚期癌癥患者中反應(yīng)良好，熱療可以增加腫瘤對放療和化療的敏感性，降低腫瘤細胞的耐藥性［1］。目前，國內(nèi)外關(guān)于熱療影響化療敏感性的機制尚有爭議。本研究旨在從細胞水平上觀察熱療作用下胃癌細胞株對紫杉醇的敏感性變化。

1 資料與方法

1.1 細胞來源及試劑 胃癌細胞株MKN-45由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳開放實驗室提供。DMEM/F12培養(yǎng)基購自加拿大Wisent公司;胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司;CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購自上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司;RIPA裂解液Ⅰ購自上海生工生物工程有限公司;多藥耐藥相關(guān)基因(multi-drug resistance gene，MDR1)及 β-actin 引物由美國Invitrogen公司合成。

1.2 主要儀器 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀購自浙江省杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Tek公司(型號:ELx800);實時熒光定量 PCR(real-time PCR，RT-PCR)儀購自美國 Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的合成及 siRNA的設(shè)計和合成用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，β-actin上游引物為 5＇-GGCCTCGCTGTCCACCTTCC-3＇，下游引物為 5＇-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTTA-3＇，擴增片段長度為255 bp;MDR1基因上游引物為 5＇-TGCCATAGCTCGTGCCCTTGTTAG-3＇，下游引物為 5＇-TGCGTGCCATGCTCCTTGACTCT-3＇，擴增片段長度為 219 bp。

siRNA由上海吉瑪藥物有限公司設(shè)計并合成。針對MDR1基因選擇3個靶點，設(shè)計3條siRNAs，序列如下:Si-1上游引物為 5＇-CACCCAGGCAAUGAUGUAUTT-3 ＇，下游引物為5＇-AUACAUCAUUGCCUGGGUGTT-3 ＇;Si-2 上游引物為 5＇-GCGAAGCAGUGGUUCAGGUTT-3 ＇，下游引物為 5＇-ACCUGAACCACUGCUUCGCTT-3＇;Si-3上游引物為5＇-CUUUGGCUGCCAUCAUCCATT-3 ＇，下游引物為 5＇-UGGAUGAUGGCAGCCAAAGTT-3 ＇，實驗中用作siRNA的陰性對照命名為 siRNA-nc，陽性對照為siRNA-β-actin。

1.3.2 胃癌細胞株的培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 對紫杉醇敏感的胃癌細胞株MKN-45用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、100 μg/mL兩性霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期MKN-45細胞接種至含紫杉醇的完全培養(yǎng)液中，紫杉醇濃度為10 μg/mL，作用48 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待恢復(fù)正常生長狀態(tài)時消化傳代，再用10 μg/mL紫杉醇處理48 h，如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高紫杉醇濃度，間歇誘導(dǎo)，最終獲得1株能耐受 300 μg/mL紫杉醇的細胞系，并將其維持培養(yǎng)在含0.1 μg/mL紫杉醇的完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8個月后建立紫杉醇耐藥細胞株，命名為MKN-45/TAX。將細胞加入6孔板，細胞濃度為2×106個/mL，將細胞分為2組:轉(zhuǎn)染siRNA-MDR1的MKN-45/TAX組，轉(zhuǎn)染 siRNA-MDR1的 MKN-45組，在 37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下孵育。按siRNA說明書進行轉(zhuǎn)染操作，以正常未作處理的MKN-45/TAX及MKN-45細胞作為對照。培養(yǎng)48 h后收獲細胞并進行檢測。

1.3.3 MDR1 mRNA水平的檢測 采用 RT-PCR法。用Trizol試劑提取細胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系:Primer11 μL、Primer21 μL、cDNA 1 μL、Mg2+3 μL、10 × Buffer 3 μL、dNTP 1 μL、Taq 酶0.5 μL、無菌水 19.5 μL。在PCR擴增儀中反應(yīng)，條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)。以β-actin管家基因作為內(nèi)參。在PCR產(chǎn)物中加入6 μL 6 × Loading Buffer混勻后，各取 10μL混合物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.3.4 P 糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)檢測 采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法。實驗分4組，分別為37℃ 1 h培養(yǎng)細胞、42℃ 1 h培養(yǎng)細胞、42℃1 h+siRNA-MDR1培養(yǎng)細胞和42℃ 1 h+siRNA-βactin培養(yǎng)細胞;每組分別有 MKN-45及 MKN-45/TAX兩種細胞。取各組細胞1×107個，按RIPA裂解液Ⅰ試劑說明書提取蛋白質(zhì)，采用BCA法進行蛋白定量，與等體積的2×SDS上樣緩沖液混合后，每泳道蛋白上樣量為20 μL，進行十二烷基磺酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%分離膠，4%濃縮膠)，然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加MDR1單克隆抗體(工作濃度為1∶100)和β-actin單克隆抗體(工作濃度為1∶1000)后4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(工作濃度為1∶5000)后室溫溫育2 h，電化學(xué)發(fā)光法檢測，曝光，顯影。

1.3.5 免疫細胞化學(xué)染色法檢測細胞中MDR1的表達 取5×103個細胞，接種至24孔板中，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)48 h，然后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍;用70%乙醇固定15 min，PBS洗3遍;加MDR1單克隆抗體后于4℃孵育1 h，PBS洗5 min，重復(fù)3次;加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，PBS洗5 min，重復(fù)3次;二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色 10 min;自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.3.6 CCK-8法檢測不同溫度下siRNA干擾前后的MKN-45/TAX與MKN-45細胞在化療藥物環(huán)境中的活力

將siRNA干擾前后的胃癌細胞株MKN-45/TAX與MKN-45分別接種至96孔板中，每孔細胞數(shù)為1×104個，培養(yǎng)2 d后每組各選18個孔，加入0.1、0.25、0.5 mg/mL 紫杉醇，在所有孔中加入 100 μL培養(yǎng)基;以不加化療藥物而種有細胞的18孔為對照組，再設(shè)3個只加100 μL培養(yǎng)基的空白對照組(不含細胞和化療藥物)。一塊板于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，另一塊板于42℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。每孔加入10 μL的CCK-8試劑孵育4 h后，放入酶聯(lián)免疫檢測儀中，于波長450 nm處測定吸光度值。將各組細胞與對照組進行比較，計算各組細胞增殖抑制率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以表示，采用t檢驗比較各組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測不同溫度下和不同濃度紫杉醇處理后各組細胞增殖抑制率 與37℃時相比，42℃時紫杉醇對MKN-45/TAX細胞的增殖抑制率明顯降低，對MKN-45的增殖抑制率明顯升高，見圖1。這說明升高溫度可提高MKN-45細胞對紫杉醇的敏感性，而顯著降低MKN-45/TAX對紫杉醇的敏感性，高溫培養(yǎng)對兩者的作用正好相反。

圖1 不同溫度下紫杉醇對胃癌細胞株的增殖抑制率

2.2 Western blotting檢測各組細胞P-gp表達的變化 37℃時MKN-45細胞中P-gp表達水平低于MKN-45/TAX細胞;2種細胞經(jīng)42℃培養(yǎng)1 h后，細胞內(nèi)P-gp的表達量都較升溫前顯著增加，且MKN-45/TAX細胞中P-gp的表達升高幅度更大。見圖2。MDR1的高表達可能是MKN-45/TAX細胞株在高溫培養(yǎng)下出現(xiàn)反常行為的主要原因。

2.3 免疫細胞化學(xué)染色法檢測各組細胞中P-gp的表達 MKN-45/TAX細胞胞漿染色明顯比MKN-45細胞深，表明前者的P-gp基礎(chǔ)表達量高于后者，見圖3。42℃培養(yǎng)后2種細胞內(nèi)P-gp的表達量都較升溫前顯著增加，且MKN-45/TAX細胞中P-gp的表達量升高幅度更大，這與Western blotting檢測結(jié)果一致。

2.4 MDR1特異性siRNA可下調(diào)MKN-45/TAX細胞中 MDR1的表達 與對照組比較，轉(zhuǎn)染靶向MDR1的3條 siRNAs后48 h時，MKN-45細胞和MKN-45/TAX細胞中MDR1 mRNA的表達均下調(diào)，其中MDR1 siRNA-2干擾效果最佳，見圖4。因此，我們采用siRNA-2進行后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染MDR1的siRNA-2后，各組細胞P-gp蛋白的表達量較相應(yīng)的對照細胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖2 Western blotting檢測不同溫度時胃癌細胞株中P-gp蛋白的表達

圖3 免疫組化檢測胃癌細胞株P(guān)-gp表達

2.5 轉(zhuǎn)染siRNA-2后高溫對各組細胞增殖抑制率的影響 將siRNA-2干擾后的兩組細胞株經(jīng)42℃培養(yǎng)并用CCK-8法檢測紫杉醇對其的增殖抑制率，siRNA-2干擾后2種細胞株對紫杉醇的敏感性均增加，并趨于一致。見圖6。

圖4 MDR1 mRNA的表達水平

圖5 Western blotting檢測MDR1 siRNA沉默前后胃癌細胞株中P-gp蛋白的表達水平

圖6 高溫時siRNA-2干擾后MKN-45及MKN-45/TAX對紫杉醇的敏感性的變化

3 討 論

熱療對細胞的殺傷作用主要取決于熱療的溫度及時間。研究［2］表明，胃癌細胞在40～43℃時凋亡最明顯，但該研究是在對化療藥物敏感的細胞和病例中進行的，目前缺乏對已發(fā)生化療耐藥的細胞和病例的實驗數(shù)據(jù)，且國內(nèi)外關(guān)于熱療影響化療敏感性的機制尚存爭議［3-4］。為此，本實驗篩選了對紫杉醇耐藥的MKN-45/TAX胃癌細胞，并就熱療對化療的增敏效果進行了研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，P-gp在MKN-45及MKN-45/TAX中均有表達，但MKN-45/TAX中P-gp表達量較高。升溫處理后，P-gp在MKN-45及MKN-45/TAX中表達均增加，說明升溫促進了P-gp表達。但是，升溫雖然增加MKN-45對紫杉醇的敏感性，但卻增加了MKN-45/TAX對紫杉醇的耐藥性。同時發(fā)現(xiàn)，升溫培養(yǎng)后，P-gp表達量在MKN-45/TAX中上升幅度顯著高于MKN-45。由此可以推測，升溫致耐藥細胞更耐藥的原因與MDR1高表達有關(guān)。為了驗證這一假設(shè)，本研究引入了特異性 siRNA，使細胞中MDR1基因沉默，然后對2種細胞進行升溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，升溫后2種細胞對紫杉醇的敏感性趨于一致，這說明P-gp高表達是MKN-45/TAX細胞在高溫培養(yǎng)下出現(xiàn)反常行為的主要原因，因此，對于耐藥細胞的這種反常行為來說，實施MDR-1干擾是一種有效的逆轉(zhuǎn)手段。

熱療能否逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，令人關(guān)注，以往研究［5］表明，熱療聯(lián)合化療可降低腫瘤細胞耐藥性，促進癌細胞凋亡。其機制主要有以下幾方面:(1)輕度高溫可破壞細胞骨架成分，改變細胞膜的通透性，并抑制腫瘤細胞的生長［4］;(2)高溫可增加藥物與DNA的交聯(lián)，降低DNA的修復(fù)能力，還可使某些蛋白質(zhì)變性，因此可能會逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥;(3)高溫減少細胞新陳代謝，使藥物轉(zhuǎn)運活化，提高細胞的藥物濃度，同時能降低癌中組織間隙液壓，增加癌組織對抗癌藥物的滲透性，直接滲透深度可達5 mm［6］;(4)富氧細胞對化療的敏感性高于乏氧細胞，乏氧細胞對熱療的敏感性高于富氧細胞，化療配合熱療可既殺滅富氧細胞，又殺滅乏氧細胞。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，高溫可上調(diào)耐藥細胞中MDR1基因的表達量，加強其耐藥性。

本研究結(jié)果證明，升溫不一定增強癌細胞對化療藥物的敏感性，相反，在某些條件下，如細胞耐藥情況下，熱療還進一步增強細胞對化療藥物的耐受能力。

［1］張峰，劉國平，劉暢，等.進展期胃癌患者術(shù)后腹腔持續(xù)溫?zé)峁嘧⒒熉?lián)合靜脈化療的療效觀察［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2011，18(3):338-340.

［2］Tao Y，Guo Y，Liu W，et al.AKT inhibitor suppresses hyperthermia-induced Ndrg2 phosphorylation in gastric cancer cells［J］.Braz J Med Biol Res，2013，46(4):394-404.

［3］Lv F，Yu Y，Zhang B，et al.Inhibitory effects of mild hyperthermia plus docetaxel therapy on ER(+/-)breast cancer cells and action mechanisms［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013，33(6):870-876.

［4］Walther W，Arlt F，F(xiàn)ichtner I，et al.Heat-inducible in vivo gene therapy of colon carcinoma by human mdr1 promoter-regulated tumor necrosis factor-alpha expression［J］.Mol Cancer Ther，2007，6(1):236-243.

［5］Stein U，Jüerchott K，Walther W，et al.Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of multidrug resistance-related ABC transporters［J］.J Biol Chem，2001，276(30):28562-28569.

［6］El-Kareh AW，Secomb TW.A theoretical model for intraperitoneal delivery of cisplatin and the effect of hyperthermia on drug penetration distance［J］.Neoplasia，2004，6(2):117-127.