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    紫貽貝中堿性磷酸酶動力學特性研究

    2014-09-28 03:23:50黃振娥
    湖南農(nóng)業(yè)科學 2014年23期
    關(guān)鍵詞:貽貝磷酸酶作圖

    黃振娥,于 貞

    (1. 煙臺欣和味達美食品有限公司,山東 煙臺264000;2. 煙臺大學,山東 煙臺264005)

    貝是一種世界性分布的沿岸底棲雙殼類海洋動物,由于其分布廣、活動性低、商業(yè)價值高、對污染物有較強的生物累積能力而備受關(guān)注,很多國家把貽貝和牡蠣等貝類作為海洋污染的指示生物,廣泛應(yīng)用于海洋污染的生物監(jiān)測[1]。堿性磷酸酶(ALP)廣泛存在于自然界中,它催化磷酸單脂的水解以及磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng),在生物體內(nèi)的磷代謝過程中起著十分重要的作用。海洋環(huán)境被污染,導致酶的構(gòu)象和活力發(fā)生改變,使得堿性磷酸酶成為生物響應(yīng)逆境環(huán)境的重要標志之一,可以作為監(jiān)測環(huán)境脅迫的生物指標[2-6]。本研究對紫貽貝中堿性磷酸酶進行提取制備,測定其活力,并研究溫度、pH 值對其活性的影響及其酶促動力學特性,為貽貝及其生化指標作為污染指示生物的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗所用紫貽貝購于煙臺大學水產(chǎn)品市場,將其清洗干凈,冷凍備用。供試試劑有:硝基苯磷酸二鈉(分析純)、硫酸銨(分析純)、三羥甲基氨基甲烷(實驗室技術(shù)級)、牛血清蛋白(特級純)、鹽酸(分析純)、考馬斯亮藍G-250(分析純)。供試儀器有:721 可見光分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)、數(shù)控超級恒溫槽(寧波天恒儀器廠)、HR2860 飛利浦攪拌機(珠海經(jīng)濟特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司)、pH 計(梅特勒-托利多儀器有限公司)、GT10-2 高速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司)、磁力攪拌器(深圳天南海北實業(yè)有限公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 酶的提取與測定 紫貽貝去殼,稱重,按質(zhì)量體積比1︰1.5(W︰V)分別加入預(yù)先冷卻的0.01 mol/L Tris·HCl 緩沖液(pH 值5.5、6.5、7.5、8.5、9.0、9.5、10.0),勻漿,10 000 r/min 離心后,上清液加入磨細的硫酸銨粉末,至硫酸銨飽和度分別為40%,4℃靜置沉淀4 h 以上,4 000 r/min 離心30 min,得到酶的粗提物。粗提物用0.01 mol/L Tris·HCl 緩沖液(pH 值與提取液相同)溶解,待測。采用磷酸苯二鈉法[4]測定酶活,酶液在堿性條件下反應(yīng)后,在405 nm 下測其OD 值。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[7]。酶的比活力(U/mg)=酶活力(U/mL)÷蛋白質(zhì)含量(mg/mL)。

    1.2.2 堿性磷酸酶性質(zhì)的研究(1)酶反應(yīng)最適pH 值的確定。測定不同pH 值下的酶活力,以酶的比活力對相應(yīng)的pH 值作圖,求出堿性磷酸酶在此反應(yīng)條件下的最適pH 值。(2)酶反應(yīng)最適溫度的確定。調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH 值為9.0,在不同溫度下測定酶活力,以酶活力對相應(yīng)的溫度作圖,確定酶作用最適溫度。(3)pH 值對酶反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。用0.1 mol/L 不同pH 值的緩沖液配制0.1%的酶液,在4℃下靜置處理30 min,然后調(diào)酶液pH 值為9.0,在37℃下測定酶活。以處理前的最初酶活力為100%,處理30 min 后的酶活力與其比值即為相對活力。(4)溫度對酶反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。酶液在不同溫度下(30、40、50、60℃)保溫0、15、30、45 和60 min 后,按常規(guī)方法測定酶活力,以處理前的最初酶活力為100%,保溫(t)min 后的酶活力與其比值即為相對活力。以相對活力對時間t 作圖,繪出溫度穩(wěn)定性曲線。(5)堿性磷酸酶動力學參數(shù)的確定。試驗以對硝基苯磷酸二鈉為底物,在pH 值9.0、溫度37℃的條件下反應(yīng)10 min,在405 nm處測定酶活,用L-B 作圖法求Km和Vmax。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 堿性磷酸酶最適pH 值的確定

    由圖1 可知,在pH 值5.5~9.0 范圍內(nèi),隨著pH 值增大,酶的比活力緩慢上升,當pH 值為9.0 時,酶活力達到最大值;當pH 值高于9.0 時,酶的比活力急劇下降。因此,確定紫貽貝中堿性磷酸酶的最適pH 值為9.0。

    圖1 pH 值對堿性磷酸酶活力的影響

    2.2 堿性磷酸酶的最適作用溫度

    由圖2 可知,在30~37℃范圍內(nèi),隨著溫度的提高,酶的比活力逐漸上升;在37℃時,酶的比活力達到最大值;高于此溫度,酶的比活力迅速下降。因此,確定紫貽貝中堿性磷酸酶的最適作用溫度為37℃。

    圖2 溫度對堿性磷酸酶活力的影響

    2.3 pH 值對堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

    由圖3 可知,堿性磷酸酶在酸性條件下不穩(wěn)定,pH值為5.5 時,處理30 min 后,堿性磷酸酶活力喪失80%;隨著pH 值的升高,堿性磷酸酶的穩(wěn)定性逐漸增大;pH值在8.5~9.5 的范圍內(nèi),堿性磷酸酶活力比較穩(wěn)定;當pH 值大于9.5 后,堿性磷酸酶的穩(wěn)定性又有所下降。

    圖3 pH 值對堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

    2.4 溫度對堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

    由圖4 可知,堿性磷酸酶在30~40℃時比較穩(wěn)定,隨保溫時間的延長,酶相對活力的下降不明顯;在50~60℃時,酶的熱穩(wěn)定性逐漸降低,隨保溫時間的延長,酶的相對活力呈下降趨勢,且溫度越高,酶穩(wěn)定性越差,酶相對活力的下降趨勢越明顯,在60℃加熱60 min后其酶活仍保留了47.5%。這說明該酶對熱具有一定的耐受力。

    圖4 溫度對堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

    2.5 堿性磷酸酶動力學參數(shù)的確定

    反應(yīng)開始時對硝基苯磷酸二鈉濃度分別為2、3、4、5、8、10 mmol/L,反應(yīng)10 min 后,測定405 nm 吸光度,用L-B 作圖法求米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率,由圖5 計算出堿性磷酸酶的米氏常數(shù)Km=0.09 mmol/L,rmax=0.22 mmol/(L·min)。

    圖5 L-B 作圖法求堿性磷酸酶的動力學參數(shù)

    3 結(jié)論

    試驗結(jié)果表明,堿性磷酸酶的最適作用pH 值為9.0,最適作用溫度為37℃;堿性磷酸酶在pH 值5.5~7.5 的偏酸性范圍內(nèi)不穩(wěn)定,而在pH 值8.5~9.5 的偏堿性范圍內(nèi)較穩(wěn)定;堿性磷酸酶的穩(wěn)定性隨溫度的增加而減弱,在60℃加熱60 min 后其酶活仍保留47.5%,說明該酶對熱具有一定的耐受力;37℃時堿性磷酸酶的動力學參數(shù)為:Km=0.09 mmol/L,rmax=0.22 mmol/(L·min)。

    [1]Widdows J,Donkin P.Mussels and environmental contaminants:bioaccumulation and physiologicalaspects[M].Amsterdam:Elsevier Press,1992.383-464.

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