兩種萬古霉素藻酸鹽微緩釋球釋放曲線的對比研究

侯天勇，許建中 (第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院骨科，全軍矯形外科中心，重慶 400038)

抗感染治療是創(chuàng)傷所致的開放性骨折、骨髓炎以及外科術(shù)后處理中必不可少的重要措施。常規(guī)抗感染治療主要通過口服或靜脈給藥，雖然可以取得一定療效，但對于嚴重骨組織感染的患者，感染骨組織周圍的血流量減少，容易導(dǎo)致藥物在血液中濃度高而局部骨組織中濃度低的現(xiàn)象，降低了治療效果。目前，應(yīng)用生物相容性好、可降解的包裹材料制備成藥物緩釋載體并移植在骨折局部的給藥方法，實現(xiàn)了直接給藥、增強藥物療效的作用。為此，筆者對纖維蛋白包裹的萬古霉素藻酸鹽微球(fibrin-gel-coated vancomycin alginate beads，F(xiàn)G-Vanco-AB)進行制備和優(yōu)化，為其在骨組織抗感染治療中的可行性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 萬古霉素藻酸鹽微球的制備和優(yōu)化

將藻酸鹽(美國Sigma公司，低粘度細胞培養(yǎng)級)溶解于去離子水，制成4%、8%、12%、16%和20%的溶液，分別與等體積的10、20和50 mg/mL的萬古霉素溶液混合。用注射器抽取后，加壓使混合溶液緩慢滴注到攪動的1.01%(w/v)氯化鈣水溶液中。10 min后，將從氯化鈣水溶液中收集的藻酸鹽微球用去離子水洗凈，－70℃凍存6 h后再低壓凍干6～8 h，直至重量不再變化后分裝保存。稱取相同質(zhì)量的由不同濃度藻酸鹽和萬古霉素溶液制備的微球，用5 mL的5%(w/v)檸檬酸三鈉溶液裂解微球，收集裂解液，以10 000 r/min離心10 min，取上清液在高效液相色譜儀上測定萬古霉素濃度。萬古霉素含量(%)=微球中萬古霉素質(zhì)量/藻酸鹽微球的質(zhì)量×100%。

1.2 FG-Vanco-AB 的優(yōu)化

16%藻酸鹽溶液與50 mg/mL萬古霉素的混合溶液制備的萬古霉素藻酸鹽微球凍干后，每組分3份，分別置入0、30、60、75和90 mg/mL的纖維蛋白原的磷酸二氫鉀(0.05 mol/L)溶液中緩慢攪動。10 min后浸入到400 IU/mL凝血酶中緩慢攪動，促進凝膠在微球表面形成一層膜，即FG-Vanco-AB，然后將其撈出，室溫風(fēng)干，稱量包裹后的微球重量。增重比率(%)=(包裹后微球質(zhì)量－包裹前微球質(zhì)量)/包裹前微球質(zhì)量×100%。

1.3 FG-Vanco-AB的體外釋放

將上述不同濃度纖維蛋白包裹的微球15 mg放置在10 mL體積的DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)中，于37℃恒溫箱中每天更換液體，收集培養(yǎng)基，以10 000 r/min離心10 min，取上清液在高效液相色譜儀上測定萬古霉素濃度。

1.4 毒性試驗

抽取體質(zhì)量為25 kg雄性山羊(第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供)髂骨骨髓10 mL，按照文獻［1］方法獲取山羊間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。取第3 代 MSCs，以 2 ×104/mL的密度接種到24孔板中，每孔加入已收集的經(jīng)不同濃度纖維蛋白包裹的微球緩釋液1 mL，以普通培養(yǎng)基作為對照，觀察MSCs的生長情況。在培養(yǎng)后1、3、5和7 d，各組選取3孔，用PBS溶液洗3次，加入1 mL普通培養(yǎng)基，加入100 μl的CCK-8 kit(日本Dojindo Lab公司)液體，在37℃孵育2 h，然后取100 μl孵育液到96孔板，通過酶標儀在450 nm測得吸光度(A)值。相對存活系數(shù)(%)=(樣本的 A值/對照的 A值)×100%。

1.5 萬古霉素的濃度與活性測定

分別將收集的樣本液進行高效液相(Waters 510泵，484紫外檢測器)分析，測得其中萬古霉素的含量。具體方法為:取上清液10～50 μl進樣，流動相為乙腈和KH2PO4溶液(0.05 mol/L)，8︰92 混合，磷酸調(diào) pH 值至 3.2，流速 1.0 mL/min，檢測波長236 nm。通過試管稀釋法測定萬古霉素對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)最小的抑菌濃度。萬古霉素被用含有0.5 mL附加陽離子的M-H肉湯連續(xù)倍加稀釋。每一組試管的葡萄球菌接種物是0.5 mL過夜的含有5.0×105/mL菌落單位的培養(yǎng)基。最小抑菌濃度是在37℃孵育24 h后能夠阻止菌液混濁的最低抗生素濃度。測定最小抑菌濃度后，取每一干凈試管中0.01 mL液體鋪在血液瓊脂平皿上。最小殺菌濃度是在37℃孵育24 h后，使平皿上菌落數(shù)目為10個或是以下的抗生素的最低濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 緩釋微球的性狀

萬古霉素藻酸鹽溶液在氯化鈣溶液中可形成淺白色的球狀物，隨著時間延長，微球顏色逐漸加深，變成乳白色，球體的硬度增加。球體的大小主要取決于滴注的藻酸鹽液滴的大小。本研究中藻酸鹽微球的大小在5 mm左右，凍干后藻酸鹽微球的體積明顯減小，縮減至大約3 mm。被纖維蛋白凝膠包裹后的藻酸鹽萬古霉素微球體積無明顯變化，經(jīng)0、30、60、75和90 mg/mL纖維蛋白溶液浸泡，再經(jīng)凝血酶塑形而形成通透膜包裹的微球的增重比率分別為(－0.27±3.65)%、(3.53±2.03)%、(6.17 ±2.22)%、(8.34 ±2.09)%、(8.79 ±2.00)%，表面變得更光滑。

2.2 藻酸鹽微球中萬古霉素的含量

在混合液中萬古霉素濃度相同的條件下，隨著藻酸鹽溶液濃度的升高，最后成形的微球中萬古霉素的含量逐漸增加。起始藻酸鹽溶液達到16%時所制備的微球中萬古霉素的含量最高，至20%時開始減低。在藻酸鹽濃度相同的條件下，微球中萬古霉素的含量隨著制備混合液中萬古霉素濃度的增加而顯著增加(圖1)。由50 mg/mL萬古霉素和16%藻酸鹽的混合液制備的微球，萬古霉素的含量最高，達(27.36±0.90)%。

圖1 不同濃度的萬古霉素和藻酸鹽溶液混合后制備的微球中萬古霉素的含量

2.3 FG-Vanco-AB釋放的萬古霉素

萬古霉素對金黃色葡萄球菌標準株(ATCC 25923)的最小抑菌濃度和殺菌濃度分別為1.20 mg/L和2.10 mg/L，藥物敏感的折點值為5 mg/L。以萬古霉素敏感的折點值作為最低濃度標準，放置未包裹的萬古霉素藻酸鹽微球的溶液中萬古霉素的濃度超過此值的連續(xù)時間為11 d，而由30、60、75和90 mg/mL纖維蛋白溶液形成包裹的FG-Vanco-AB溶液中，釋放的萬古霉素的濃度超過5 mg/L的時間分別為13、17、19和19 d(圖2)。

圖2 不同濃度纖維蛋白凝膠包裹的萬古霉素藻酸鹽微球在體外釋放的萬古霉素的濃度。圖中橫線表示對標準菌株(ATCC 25923)具有敏感殺滅作用的折點值的萬古霉素的濃度(5 mg/L)

2.4 毒性試驗

MSCs在各實驗組中均表現(xiàn)較明顯的增殖趨勢，細胞形態(tài)正常。各組相對生存率在培養(yǎng)后1 d均有不同程度的降低，3 d降低較明顯，5 d至最低(各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義);培養(yǎng)后7 d各組的相對生存率均出現(xiàn)不同程度的升高(圖3)。

圖3 不同濃度纖維蛋白凝膠包裹的萬古霉素藻酸鹽微球?qū)才囵B(yǎng)的MSCs增殖的影響

3 討論

藻酸鹽是天然的可吸收材料，屬于多糖類物質(zhì)，主要從褐藻中提取，其主要成分為β-D-甘露糖醛酸(M殘基)和α-L-古洛糖醛酸(G殘基)，具有優(yōu)良的生物相容性和可降解特性，在鈣離子溶液中即可形成熱穩(wěn)定凝膠，不需要高溫或有機化學(xué)試劑交聯(lián)，有利于其作為可溶性緩釋藥物的包裹材料［2-3］。目前，利用藻酸鹽優(yōu)良的生物學(xué)特性制備的局部抗生素控釋微球已經(jīng)被用于慢性骨髓炎的治療研究，取得了較好的治療效果［4］。但是，單純的萬古霉素藻酸鹽緩釋微球釋放的藥物達到有效治療濃度的持續(xù)時間還不足夠長［5］，已有左旋多聚賴氨酸被用于包裹藻酸鹽抗生素微球，其藥物有效釋放時間得到延長［3］。筆者設(shè)計了FG-Vanco-AB緩釋系統(tǒng)，對相應(yīng)的條件進行優(yōu)化，萬古霉素的有效釋放時間較前有所延長。

大量的抗生素可供臨床和實驗研究使用，但是，針對目前骨組織感染的救治現(xiàn)狀，大量的耐藥菌株的出現(xiàn)以及藻酸鹽的包裹特性，萬古霉素是最佳的選擇對象。萬古霉素是一種糖肽類抗生素，對引起骨感染常見的革蘭陽性菌具有很強的殺滅能力，其中包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄菌(包括耐甲氧西林菌株)，以及鏈球菌(包括化膿性鏈球菌)等［6-7］。同時，萬古霉素易溶于水，可同藻酸鹽制成混合溶液，通過滴注形成緩釋微球。萬古霉素?zé)o明顯的毒副作用，不像青霉素類會引起強烈的變態(tài)反應(yīng)。

用于局部埋置的藥物緩釋包裹材料的選擇應(yīng)當(dāng)具有以下特點:生物相容性好，降解成分可被人體吸收;載藥量高，可以滿足局部用藥的需要;所包裹的藥物釋放平緩，具有較低的突釋率，避免瞬間形成可引起副作用的高藥物濃度。藻酸鹽具有良好的生物相容性和可降解特性，已被廣泛用作細胞載體和藥物緩釋載體［8-9］。而異體和(或)異種纖維蛋白凝膠也因為其良好的生物相容性和黏附特性在臨床中得以使用。如果使用患者自身的血漿制備凝膠，則可以完全避免潛在的誘導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的危險。

在本研究中，通過調(diào)整制備微球的藻酸鹽和萬古霉素的起始濃度，優(yōu)化篩選萬古霉素含量最高的緩釋微球，提高單位質(zhì)量微球的載藥量，可以減少局部用藥時緩釋載體的放置量，避免過多的外源性物質(zhì)對局部組織成骨可能造成的影響。同時，通過低壓凍干和表面包裹纖維蛋白凝膠，使微球的儲存更為方便，并延長了萬古霉素的釋放時間［10］。實驗結(jié)果還表明，用于包裹藻酸鹽微球的纖維蛋白凝膠的兩種成分纖維蛋白原和凝血酶的濃度越高，微球中萬古霉素的突釋越少，其釋放時間越長，這同 Jeon等［11］的研究相一致。具體原因在于形成纖維蛋白凝膠的主體是纖維蛋白原，凝血酶只是促進纖維蛋白原3條鏈當(dāng)中的2條鏈αA和βB斷裂，釋放多肽A和B，使其轉(zhuǎn)化為纖維蛋白單體，相互間自發(fā)聚集形成多聚體;同時凝血酶激活ⅩⅢ因子，激活的ⅩⅢ因子在Ca2+的作用下催化各纖維蛋白單體間的第三條鏈γ的谷氨酰胺殘基和賴氨酸的ε-氨基形成共價鍵，最終形成網(wǎng)狀的纖維蛋白多聚體［12］。纖維蛋白凝膠的包裹就像一層膜，纖維蛋白原的濃度越高，形成的膜越致密，孔徑越小，限制了水分進入到藻酸鹽微球，因而減少了萬古霉素的洗脫。同時，高濃度成分形成的包裹外膜強度也高，限制了微球吸水后的膨脹，因而減慢了微球的崩解，延長了藥物釋放時間。凝血酶的濃度選定為400 IU/mL，而并未進行濃度優(yōu)化，主要是基于以下考慮:形成的纖維凝膠蛋白膜的致密程度和強度主要是由纖維蛋白原的濃度決定的，凝血酶只是觸發(fā)反應(yīng)的酶;高濃度的凝血酶(如400 IU/mL)才可以保證在短時間內(nèi)微球表面形成均勻一致的膜;縮短酶促反應(yīng)時間，減少微球在溶液中浸泡的時間，避免微球中包含的藥量因為浸泡而丟失。

藥物緩釋載體的安全性以及是否能夠滿足治療需要也是本研究觀察的重點。通過將不同方式處理的微球同MSCs共培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)和活力的變化來評價其安全性，我們發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)良好，活力輕度受抑制，體現(xiàn)了較好的安全性。對于緩釋微球療效的評價，主要是定時收集微球緩釋的溶液并以高效液相色譜儀測定其中萬古霉素濃度，以標準的ATCC 25923金黃色葡萄球菌株作為參照，通過測定萬古霉素對其具有敏感殺滅作用的折點值，觀察微球釋放的萬古霉素濃度可以滿足殺滅金黃色葡萄球菌的時間長短。研究顯示，有效的釋放天數(shù)最長可達19 d，較其他包裹方式有所延長［3］。同時，高效液相色譜儀的應(yīng)用，一方面可以提高溶液中萬古霉素濃度檢測的靈敏度，另一方面，根據(jù)待測物質(zhì)出現(xiàn)峰形的時間，還可以判斷是否為萬古霉素而非其他物質(zhì)。

總之，通過優(yōu)化萬古霉素和藻酸鹽混合溶液的不同比例，篩選高含量的萬古霉素藻酸鹽微球。再通過調(diào)整包裹萬古霉素藻酸鹽微球的纖維蛋白凝膠的構(gòu)成成分纖維蛋白原的濃度，篩選萬古霉素緩釋時間長的微球，在此基礎(chǔ)上進一步檢測其對共培養(yǎng)細胞的毒性和對標準菌株的活性。結(jié)果顯示FG-Vanco-AB釋放的萬古霉素濃度體外達到可殺滅標準菌株的時間為19 d，對共培養(yǎng)細胞增殖影響微弱，提示其在骨科抗感染治療中具有潛在的應(yīng)用價值。

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