酶聯免疫法與間接血凝法檢測實驗動物家兔弓形蟲抗體的結果比較

潘嚴　李彩云　陳嘯天等

[摘要] 目的 分析比較酶聯免疫法（ELISA）和間接血凝法（IHA）在本實驗室檢測實驗用家兔弓形蟲特異性抗體的可行性。 方法 應用ELISA和IHA兩種方法平行檢測實驗感染弓形蟲的12只家兔陽性血清和未感染過弓形蟲的30只正常家兔陰性血清中的弓形蟲特異性抗體。比較兩種方法敏感性、特異性、檢測效率及Youden指數并運用kappa值進行一致性的評價。 結果 IHA法的敏感性41.67%，特異性93.33%，ELISA法的敏感性100%，特異性100%。ELISA方法的敏感性、特異性、檢測效率及Youden指數都在IHA方法之上。兩種方法的總符合率是78.57%。kappa值=0.3998。 結論 ELISA法與IHA法在本次平行檢測中的一致性較差。ELISA方法敏感性、特異性明顯優(yōu)于IHA方法，更適用于實驗動物家兔的弓形蟲特異性抗體的檢測。

[關鍵詞] 弓形蟲，抗體；酶聯免疫試驗；間接血凝試驗

[中圖分類號] R446.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）17-113-05

[Abstract] Objective To analyze and compare the feasibility of using ELISA and IHA in our laboratory for testing specific TOX-Ab in laboratory rabbit. Methods Used ELISA and IHA methods for a parallelized testing of the specific TOX-Ab contained in both the positive serum of 12 rabbits infected with toxoplasma gondii and negative serum of 30 uninfected rabbits， thus to compare the sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index between the two methods before applying Kappa values for a consistency evaluation. Results The sensibility and specificity of IHA was 41.67% and 93.33% respectively， while that for ELISA are both 100%. The sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index for ELISA are higher than that of IHA. The total consistency rate for such two methods was 78.57% with Kappa value equals to 0.3998. Conclusion The consistency between the use of ELISA and IHA for this parallelized testing is relatively poor， and ELISA is notably better than IHA in terms of sensitivity and specificity， therefore it is more suitable to be applied in the testing of the specific TOX-Ab in laboratory animal-rabbit.

[Key words] Toxoplasma gondii； Antibody； ELISA； IHA

剛地弓形蟲簡稱弓形蟲是寄生于貓科動物的腸道寄生蟲，寄生于人體腦、眼、肺、心臟、淋巴結等組織引起寄生蟲病。該蟲是一種重要的機會致病原蟲，尤其在宿主免疫功能低下時，可導致嚴重的后果。弓形蟲呈世界性分布，西方發(fā)達國家和地區(qū)感染率較高，在美國所有肉食品中豬肉被認為是人類弓形蟲病的最大肉食性來源。據國外報道，人群的平均感染率是25%～50%，有人推算全世界約有至少5億人感染弓形蟲[1-2]。自從1957年我國于恩庶第一個成功地從貓和兔子體內分離到弓形蟲病原體開始，逐步發(fā)現我國人群感染弓形蟲病原體較為廣泛。人和許多動物都能感染，引起人畜共患的弓形蟲病[3]。弓形蟲檢測方法有很多，比較常用的有病原學檢查方法如動物接種法，直接染色鏡檢法。分子生物學診斷方法如PCR技術、核酸分子雜交技術（主要是DNA探針技術）、單克隆抗體技術以及基因芯片技術應用于檢測弓形蟲感染，基因芯片技術更具有靈敏、特異、早期診斷的意義，但由于基因診斷技術的高度的敏感性，操作不當，容易產生假陽性。

迄今最常用的是檢測弓形蟲抗體的血清學方法。1994年的實驗動物寄生蟲檢測國標上規(guī)定間接血凝方法（IHA）是檢測實驗動物弓形蟲抗體的兩種主要的方法之一（另一種方法是IFA方法），但該方法操作耗時，結果判斷容易受主觀因素影響。酶聯免疫法（ELISA）是很多學者公認的檢測弓形蟲抗體的一種可重復的方法，具有靈敏度高、特異性強、結果判斷客觀等優(yōu)點，已被廣泛應用人弓形蟲病的免疫學診斷[4]。并且2008年重新修訂的國標上已新增ELISA方法為實驗動物弓形蟲抗體的檢測方法。研究表明[5]，對ELISA和其他一些血清學方法診斷弓形蟲病進行評價，認為該法是檢測弓形蟲抗體的一種可重復的方法，易自動化和標準化。目前，臨床上多采用同時檢測IgM、IgG的方法來診斷現癥感染。近幾年主張采用兩種或多種方法結合提高診斷的準確率，可以將IHA與ELISA或IFA同用，以提高的檢出率和準確度[6]。新的弓形蟲病的診斷方法主要在于提高敏感性和特異性，以及使操作更為簡便快捷。本研究運用ELISA和IHA方法對同一批家兔血清進行檢測，并對這兩種定性實驗檢測方法的結果作比較分析。

1 材料與方法

1.1 陽性血清

由上海市疾控中心提供12只實驗感染弓形蟲速殖子的家兔血清并用染色方法（DT）檢測確診的陽性標本。

1.2 陰性血清

本實驗室提供已用染色方法（DT）檢測確診陰性的健康家兔血清標本。

1.3 試劑

動物用弓形蟲抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）從珠海經濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司購得。其中主要成分及批號為：（1）酶標記物，20131106；（2）濃縮洗滌液，770131114；（3）顯色液A，720130916；（4）顯色液B，730131105；（5）樣品稀釋液，720130916；760130905；（6）終止液，740131104；（7）陽性對照，20131106；陰性對照，20131106，臨界對照，20131106。弓形蟲抗體間接血凝試驗試劑盒，購于中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，批號：20131205。

1.4 儀器設備

SPECTRAmax340pc酶標儀，Thermo（815）恒溫培養(yǎng)箱，各種刻度的微量移液器，96（12×8）孔1100 V形有機玻璃板，微型震蕩器等。

1.5 檢測方法

1.5.1 IHA試驗操作步驟 （1）配制診斷液：弓形蟲IHA診斷試劑按瓶上標示毫升數加滅菌蒸餾水稀釋搖勻，2000r/min離心10min棄上清液，加等量的稀釋液搖勻，置4℃下靜置24h后使用。（2）加稀釋液：用微量移液器在96孔有機玻璃反應板的每孔加75μL，每個樣品需加稀釋液3孔，均應設陽性血清、陰性血清、空白對照。陰、陽性對照加8孔（其中第8孔為稀釋液對照）。（3）加待測血清、陽性對照血清、陰性對照血清：第1孔加相應血清25μL。（4）稀釋：定性檢測稀釋到第3孔，對照血清稀釋到第7孔，定性檢測的第4孔、對照血清的第8孔為稀釋液對照。（5）加診斷液：將診斷液搖勻，每孔加25μL診斷液，加完后將反應板置微量振蕩器上振蕩1～2min，取下反應板，蓋上一塊與反應板大小相近的玻璃置37℃作用2～3h后觀察結果。（6）結果判定方法：在陽性對照血清效價不低于1∶1024，陰性對照血清除第1孔允許有前滯現象“+”外，其余各孔均為“-”稀釋液對照為“-”的前提下，待檢血清效價達到或超過1∶64為陽性?！?+”為陽性終點。

1.5.2 ELISA試驗操作步驟 （1）洗滌液配制：試劑盒放置室溫平衡20～30min。濃縮洗滌液用去離子水10倍稀釋。（2）樣品稀釋：樣品1∶100稀釋：將樣品稀釋液1mL加入一潔凈小管內，加10μL待檢樣品，充分混勻。（3）加樣反應：加板條固定于板架上，剩余的板條用不干膠密封并放入密封袋中保存。每孔加入稀釋后樣品100μL。臨界對照加3孔，陰、陽性對照各加1孔，100μL/孔。另留一孔不加任何液體為空白對照。置37℃30min。（4）加酶反應：甩凈孔中液體，洗板3次，每次停留1min后甩凈拍干，除空白對照外每孔加酶標記物1滴，置37℃30min。（5）顯色反應：甩凈孔中液體，同上洗板3次，拍干后各孔滴加顯色液A、B各1滴，置37℃避光10min。（6）終止反應：每孔立即加入終止液1滴，混勻后用酶標儀450nm讀數判定結果。（7）結果判定：以空白孔調零，450nm波長測定OD值。陰性對照值≤0.20，臨界對照OD值0.20～0.60，陽性對照值>0.60，證明實驗成立。按以下方法判斷：陽性：樣品OD值>臨界對照OD值平均值×1.1；可疑：臨界對照OD值平均值×0.9≤樣品OD值≤臨界對照OD值平均值×1.1；陰性：樣品OD值<臨界對照OD值平均值×0.9。

1.6 統計學處理

檢測數據用SPSS16.0進行一致性檢驗。

2 結果

2.1 IHA檢測結果

應用IHA方法檢測已知兔陽性血清1～12號樣本中，3#、5#、8#、9#、11#5個樣本紅細胞部分呈膜狀沉著，周圍有凝集團點，中央沉點大。血清效價≥1∶64判定為“++”，其余7個樣本紅細胞沉集于中心，周圍無沉著物，分界清楚。血清效價<1∶64均呈陰性反應。

應用IHA方法檢測已知兔陰性血清1～30號樣本中，除了16#、22# 2個樣本血清效價≥1∶64判定為“++”，其余28個樣本均呈陰性反應。

根據以上檢測結果得出IHA方法檢測已知兔陽性血清的敏感性是41.67%，檢測已知兔陰性血清特異性是93.33%。見表1。

3 討論

自從上個世紀60年代于恩庶等在國內首先建立DT染色試驗用于檢測弓形蟲感染以來，現有的弓形蟲感染的血清學診斷技術不下10余種。雖然DT試驗特異強，敏感性高已被公認，但是DT染色試驗需要弓形蟲活的蟲體，在實際應用中不易開展。因此現在國內已不再有人用此方法來檢驗弓形蟲感染。目前主要用抗體檢測法，如補體結合試驗（CT），間接血凝試驗（IHA），乳膠凝集試驗（LAT），碳粒凝集試驗（CAT），間接免疫熒光試驗（IFA），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。應用較多的是IHA、ELISA和IFA。IHA有商品抗原供應，操作方法簡便，所以應用較廣。ELISA敏感性特異性優(yōu)于IHA。間接血凝試驗（IHA）其原理是抗原包被于紅細胞表面成為載體再與相應的抗體結合，從而使紅細胞聚集在一起，出現肉眼可見的凝集反應。但容易發(fā)生非特異性凝集現象。Jacob和Lunde1957年首次將間接血凝實驗用于檢測弓形蟲病[8]。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，與受檢血清中特異性的抗體結合，形成固相抗原抗體復合物，再與酶標抗抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶，催化底物3，3—5，5—四甲基聯苯胺顯色，3，3—5，5—四甲基聯苯胺顯色，用酶標儀在450nm波長下讀取OD值，判定有無弓形蟲特異性抗體，結果較為客觀。而IHA方法僅依靠肉眼識別凝集顆粒的有無以及大小，主觀因素的影響不可忽視。此外，實驗室之間，不同批號制備的致敏紅細胞的質量大相徑庭，重復性較差，這些缺點客觀上不利于IHA方法的廣泛使用。然而，IHA方法簡便快速，所用器材簡單，便于大批量樣品基層單位使用。ELISA方法的操作簡便快捷，但對操作和時間的要求比較嚴格。另外，ELISA是診斷弓形蟲感染應用最廣的技術之一，ELISA試劑盒的最明顯的優(yōu)點是設計的親和力[9]。

當前ELISA方法在檢測弓形蟲病原診斷方面具有廣闊的應用前景。國外不少實驗室也有用重組抗原診斷弓形蟲病。如Lecordier等用重組的致密顆?？乖―ense granule antigen，GRA）GRA1和GRA6作為診斷用抗原取得良好的結果[10]。國內賈雪梅等也建立了GRA1基因體外擴增方法，進一步研究發(fā)現GRA1與GRA6-Nt聯合應用可使敏感性達到98%。GST-GRA6-Nt與GAR1聯合采用ELISA法可于弓形蟲病的血清學診斷[10]。親和素-生物素-酶聯免疫吸附試驗（ABC-ELISA）國內外資料顯示，其敏感性比ELISA法高出3～8倍，開拓了ELISA在弓形蟲微量抗原/抗體的檢測方面的新路。其原理是通過親和素對生物的高度親和力與導入生物素的酶分子緊密結合，能產生放大作用。另外，斑點酶聯免疫吸附試驗（Dot-ELISA），雙夾心酶聯免疫吸附試驗（DS-ELISA），抗體抗體親合度（Avidity）的酶聯免疫吸附試驗等這些新型改良后的ELISA方法使顯色更為清晰，能減少假陽性率的發(fā)生。抗體抗體親合度（Avidity）的酶聯免疫吸附試驗最早由Hedman等使用，這種方法可以確認4、5個月前的感染，對于檢測懷孕動物最初期的抗弓形蟲IgG、IgM陽性非常有用。ELISA和免疫印跡實驗（IBT）方法目前主要用于檢測弓形蟲的特異循環(huán)抗原或抗體，廣泛用于現癥感染。國內周永安等認為這兩種方法各有其優(yōu)缺點，在人和動物弓形蟲病的診斷方面?zhèn)鹘y診斷應與其他新的診斷技術取長補短，相互補充才能在弓形蟲病的診斷中發(fā)揮其應有的主要作用[11]。

本研究應用ELISA和IHA兩種方法，平行檢測12只弓形蟲IgG抗體陽性兔血清和30只弓形蟲IgG抗體陰性兔血清。結果提示本次實驗中兩種方法陽性符合率是41.67%，陰性符合率93.33%?？偡下?8.57%。ELISA方法的敏感性特異性均在IHA方法之上。呂元聰等采用同一批血清對IHA、IFA、ELISA三種血清學方法診斷弓形蟲病進行了比較研究，結果IHA、IFA、ELISA檢出的陽性率分別為6.9%、8.5%、15.4%。以ELISA法最為敏感。然后再用ELISA與IHA法進行特異性實驗在同一條件下分別進行對照實驗、重復實驗和交叉實驗。結果提示ELISA法有良好的特異性[12]，與本次實驗的結果相似。然而本次實驗中兩種方法檢測結果的一致性較差（kappa值=0.3998），出現這種結果可能與兩種方法的試劑盒原理、操作步驟、和結果判定等因素存在著差異相關。ELISA方法的敏感性和特異性、檢測效率、Youden指數均高于IHA方法。

4 結論

本實驗室采用兩種方法平行檢測家兔弓形蟲抗體的結果表明，雖然ELISA方法和IHA方法均可用于檢測實驗動物兔的弓形蟲抗體，但前者敏感性、特異性、檢測效率及Youden指數均優(yōu)于后者，更適用于實驗動物家兔的弓形蟲特異性抗體的檢測。

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（收稿日期：2014-06-27）