冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后保存條件及使用效期的優(yōu)化選擇

邱玉霞　韓惠云　張國(guó)平等

[摘要] 目的 優(yōu)化選擇冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存條件及使用效期，保證其在血型血清學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。 方法 從冰凍保存的亞型紅細(xì)胞中，選擇10份儲(chǔ)存量較大、弱抗原與抗血清的反應(yīng)強(qiáng)度為2﹢～3﹢ 的標(biāo)本，融化洗滌后將壓積紅細(xì)胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細(xì)胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時(shí)，分別檢測(cè)四組紅細(xì)胞上清中的FHb含量及紅細(xì)胞A、B抗原的反應(yīng)強(qiáng)度。以紅細(xì)胞每天置室溫1h再恢復(fù)2～6℃儲(chǔ)存的模式下，F(xiàn)Hb濃度達(dá)1.0g/L，同時(shí)紅細(xì)胞血型抗原減弱達(dá)1﹢的最小儲(chǔ)存天數(shù)再減10d作為其使用效期。 結(jié)果 （1）四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，上升幅度越大；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，F(xiàn)Hb達(dá)到1.0g/L的時(shí)間分別為>60d、60d、50d、30d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為50、40、30、10d。（2）四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，紅細(xì)胞血型抗原的反應(yīng)強(qiáng)度逐漸減弱；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，抗原出現(xiàn)減弱的時(shí)間越早；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達(dá)到1﹢的時(shí)間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為>60、60、50、20d。 結(jié)論 冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存質(zhì)量與保存介質(zhì)、溫度、時(shí)間密切相關(guān)。以MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，置2～6℃冰箱儲(chǔ)存，室溫下使用時(shí)間每天控制在1h以內(nèi)為其最佳保存條件；以MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)的使用效期確定為40d；以血漿作為保存介質(zhì)的使用效期則確定為20d。

[關(guān)鍵詞] 冰凍亞型紅細(xì)胞；融化洗滌；保存；質(zhì)量

[中圖分類號(hào)] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）17-12-04

[Abstract] Objective To optimize the preservation conditions and validity period of frozen subgroup red blood cells after melting and washing to ensure its effects in blood group serology test. Methods 10 samples with large storage capacity and weak antigenicity and antiserum reaction intensity of 2+-3+ were selected from frozenly preserved subgroup red blood cells. After melting and washing， the packed red blood cells were divided into two shares which were mixed with 1.5 times of AB subgroup plasma and MAP red blood cell preservation fluid for suspension. Adding gentamicin sulfate with final concentration of 0.05mg/mL then equally diving each of the two shares into four groups. Group 1 was preserved in the fridge under temperature of 2-6℃， and Group 2， 3 and 4 were kept under room temperature for 0.5h， 1h and 2h each day before preservation in the fridge under temperature of 2-6℃. The supernatant FHb content and the reaction intensity of red blood cell antigen A and B were tested at 0d， 10d， 20d， 30d， 40d， 50d and 60d after preservation. With red blood cells kept under room temperature for 1h each day before preservation in the fridge under temperature of 2-6℃， the validity period was defined as the minimal storage days （for FHb concentration to reach 1.0g/L and the blood group antigen reaction intensity to decrease to 1+） minus 10d. Results （1） The supernatant FHb content gradually increased with prolonged preservation of red blood cells， the longer preservation under room temperature， the greater increase. With MAP as the preservation medium， it took >60d， 60d， 50d， 30d for FHb to reach 1.0g/L for red blood cells kept under room temperature for 0h， 0.5h， 1h and 2h respectively. With AB subgroup plasma as the preservation medium， it took 50d， 40d， 30d and 10d respectively. （2） Blood group antigen reaction intensity gradually decreased with prolonged preservation of red blood cells， the longer preservation under room temperature， the earlier appearance of decreased antigen reaction intensity. With MAP as the preservation medium， it took >60d， >60d， 60d， 40d for the blood group antigen reaction intensity to decrease to 1+ for red blood cells kept under room temperature for 0h， 0.5h， 1h and 2h respectively. With AB subgroup plasma as the preservation medium， it took>60d， 60d， 50d， s0d respectively. Conclusion The preservation quality of frozen subgroup red blood cells after melting and washing is closely related to the preservation medium， temperature and time. The optimal preservation conditions are as follows： using MAP red blood cell preservation fluid as the preservation medium， preservation in fridge under temperature of 2-6℃， application under room temperature for no more than 1h each day. The validity period was defined as 40d with MAP red blood cell preservation fluid as the preservation medium and 20d with plasma as the preservation medium.endprint

[Key words] Frozen subgroup red blood cell； Melting and washing； Preservation； Quality

甘油作為最常用的細(xì)胞內(nèi)低溫保護(hù)劑，已廣泛應(yīng)用于紅細(xì)胞的低溫保存。利用該方法保存紅細(xì)胞，可使紅細(xì)胞壽命長(zhǎng)達(dá)10年，甚至延長(zhǎng)到21年[1]。我站利用該原理對(duì)日常工作中遇到的ABO亞型標(biāo)本進(jìn)行冰凍保存，并作為弱陽(yáng)性參考品對(duì)多家單克隆抗血清試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，從中挑選對(duì)亞型檢出率高的試劑用于獻(xiàn)血者血型鑒定的初、復(fù)檢，在一定程度上提高了獻(xiàn)血者的ABO亞型檢出率[2-3]。為進(jìn)一步將ABO亞型紅細(xì)胞作為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，有效應(yīng)用于獻(xiàn)血者ABO血型鑒定的室內(nèi)質(zhì)控及醫(yī)院供血庫(kù)ABO血型鑒定的質(zhì)量測(cè)評(píng)等工作中，本研究對(duì)冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存條件及使用效期進(jìn)行優(yōu)化選擇，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9%Nacl注射液、抗-A、抗-B（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；1.6%Nacl溶液（由9%和0.9%Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測(cè)定試劑盒（北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團(tuán)有限公司）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫(yī)療儀器廠）；LD5-2A型臺(tái)式離心機(jī)（北京雷勃爾公司）。

1.2 紅細(xì)胞分組和保存

從本站建立的冰凍亞型紅細(xì)胞信息庫(kù)[4]中，選擇10份儲(chǔ)存量較大、弱抗原與抗血清的反應(yīng)強(qiáng)度為2+～3+的標(biāo)本，融化洗滌后將壓積紅細(xì)胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細(xì)胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時(shí)，分別檢測(cè)四組紅細(xì)胞相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。

1.3 紅細(xì)胞質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

用鄰甲聯(lián)苯胺法檢測(cè)紅細(xì)胞上清中FHb含量；用鹽水試管法[5]檢測(cè)紅細(xì)胞A、B抗原。以紅細(xì)胞每天置室溫1h再恢復(fù)2～6℃儲(chǔ)存的模式下，F(xiàn)Hb濃度達(dá)1.0g/L，同時(shí)紅細(xì)胞血型抗原減弱達(dá)1+的最小儲(chǔ)存天數(shù)再減10d作為其使用效期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，F(xiàn)Hb檢測(cè)數(shù)據(jù)用（）表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表1、表2。

3 討論

紅細(xì)胞在體外保存過程中可發(fā)生一系列生物和毒性改變，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)其變化更加顯著，統(tǒng)稱為“紅細(xì)胞保存損傷”。包括細(xì)胞形態(tài)變化、膜結(jié)構(gòu)改變、ATP含量減少、乳酸堆積、K+的流失和Na+的聚集等，其中細(xì)胞膜帶3蛋白結(jié)構(gòu)的變化和脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)引起的氧化損傷，可導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)生裂解[6]，不但嚴(yán)重影響紅細(xì)胞血型抗原成分的穩(wěn)定性，而且使細(xì)胞內(nèi)的Hb游離出細(xì)胞外。所以測(cè)定紅細(xì)胞抗原的反應(yīng)性和上清中FHb濃度，可反映紅細(xì)胞膜的破壞情況，是評(píng)價(jià)紅細(xì)胞保存質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究通過分組設(shè)計(jì)，重點(diǎn)觀察不同保存介質(zhì)、保存溫度及保存時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞抗原及FHb的影響程度，從而確定冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的最佳保存條件及使用效期，以保證其在血型血清學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。

由表1可見，四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，上升幅度越大；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，F(xiàn)Hb達(dá)到1.0g/L的時(shí)間分別為>60、60、50、30d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為50、40、30、10d。由表2可見，四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，紅細(xì)胞血型抗原的反應(yīng)強(qiáng)度逐漸減弱；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，抗原出現(xiàn)減弱的時(shí)間越早；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達(dá)到1+的時(shí)間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為>60、60、50、20d。由此可見，冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存質(zhì)量與紅細(xì)胞的保存介質(zhì)、保存溫度和保存時(shí)間密切相關(guān)，也充分證明優(yōu)化選擇紅細(xì)胞保存條件及使用效期的重要性和必要性。

從紅細(xì)胞的保存介質(zhì)進(jìn)行分析，由于紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產(chǎn)生ATP的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生乳酸和丙酮酸等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在體內(nèi)可被其他組織氧化利用，而在體外狀態(tài)下卻因得不到充分利用而使其pH下降，而pH過低時(shí)會(huì)引起ATP從紅細(xì)胞中的釋放速率加快，導(dǎo)致紅細(xì)胞ATP耗竭，從而使紅細(xì)胞壽命走向終結(jié)[7-8]。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，在一定時(shí)間內(nèi)，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細(xì)胞提供足夠的ATP[9-11]，甘露醇則具有抵抗紅細(xì)胞溶解和加固細(xì)胞膜的作用，所以能有效維持紅細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，其保存效果明顯優(yōu)于血漿介質(zhì)。從紅細(xì)胞的保存溫度及保存時(shí)間進(jìn)行分析，因?yàn)檠菏且环N熱敏物質(zhì)，對(duì)溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細(xì)胞代謝速率越快，能量消耗越多[12-13]，隨著保存介質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗以及代謝產(chǎn)物的逐漸堆積，進(jìn)一步加重了紅細(xì)胞的儲(chǔ)存損傷，繼而使紅細(xì)胞裂解死亡。所以，紅細(xì)胞在2～6℃冰箱保存效果最好，工作中應(yīng)盡量縮短室溫放置時(shí)間，從而有效保證紅細(xì)胞的儲(chǔ)存質(zhì)量。

綜上考慮，冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后，以MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，于2～6℃冰箱中儲(chǔ)存效果最佳，工作中每天室溫使用時(shí)間應(yīng)控制在1h以內(nèi)，且時(shí)間越短，保存質(zhì)量越好。紅細(xì)胞用MAP保存液保存時(shí)，使用有效期確定為40d。該方法適用于將冰凍亞型紅細(xì)胞作為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，用于無償獻(xiàn)血者ABO血型鑒定室內(nèi)質(zhì)控時(shí)所需質(zhì)控品的制備和保存。紅細(xì)胞用血漿作為保存介質(zhì)時(shí)，使用有效期確定為20d。該方法適用于對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)供血庫(kù)進(jìn)行ABO血型鑒定質(zhì)量測(cè)評(píng)、供血庫(kù)輸血技能比武以及血型血清學(xué)培訓(xùn)等工作中所需亞型標(biāo)本的制備和保存。其他工作中如果紅細(xì)胞能在20d內(nèi)使用完畢，對(duì)懸浮介質(zhì)也無特殊要求，比如對(duì)單克隆試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)、輔助鑒定某些亞型等，則不論選擇哪一種保存方法，均能保證紅細(xì)胞的使用效果。

[參考文獻(xiàn)]

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[3] 邱玉霞，竇茉莉，李雪英.冰凍亞型紅細(xì)胞在抗血清試劑選擇中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（19）：70-71.

[4] 李雪英，邱玉霞，竇茉莉.冰凍亞型紅細(xì)胞的保存及應(yīng)用[J].山東醫(yī)藥，2012，52（35）：90-91.

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[13] 馬慶.深低溫長(zhǎng)期保存紅細(xì)胞的效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)輸血雜志，2012，25（9）：837-840.

（收稿日期：2014-06-08）endprint

[Key words] Frozen subgroup red blood cell； Melting and washing； Preservation； Quality

甘油作為最常用的細(xì)胞內(nèi)低溫保護(hù)劑，已廣泛應(yīng)用于紅細(xì)胞的低溫保存。利用該方法保存紅細(xì)胞，可使紅細(xì)胞壽命長(zhǎng)達(dá)10年，甚至延長(zhǎng)到21年[1]。我站利用該原理對(duì)日常工作中遇到的ABO亞型標(biāo)本進(jìn)行冰凍保存，并作為弱陽(yáng)性參考品對(duì)多家單克隆抗血清試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，從中挑選對(duì)亞型檢出率高的試劑用于獻(xiàn)血者血型鑒定的初、復(fù)檢，在一定程度上提高了獻(xiàn)血者的ABO亞型檢出率[2-3]。為進(jìn)一步將ABO亞型紅細(xì)胞作為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，有效應(yīng)用于獻(xiàn)血者ABO血型鑒定的室內(nèi)質(zhì)控及醫(yī)院供血庫(kù)ABO血型鑒定的質(zhì)量測(cè)評(píng)等工作中，本研究對(duì)冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存條件及使用效期進(jìn)行優(yōu)化選擇，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9%Nacl注射液、抗-A、抗-B（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；1.6%Nacl溶液（由9%和0.9%Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測(cè)定試劑盒（北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團(tuán)有限公司）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫(yī)療儀器廠）；LD5-2A型臺(tái)式離心機(jī)（北京雷勃爾公司）。

1.2 紅細(xì)胞分組和保存

從本站建立的冰凍亞型紅細(xì)胞信息庫(kù)[4]中，選擇10份儲(chǔ)存量較大、弱抗原與抗血清的反應(yīng)強(qiáng)度為2+～3+的標(biāo)本，融化洗滌后將壓積紅細(xì)胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細(xì)胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時(shí)，分別檢測(cè)四組紅細(xì)胞相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。

1.3 紅細(xì)胞質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

用鄰甲聯(lián)苯胺法檢測(cè)紅細(xì)胞上清中FHb含量；用鹽水試管法[5]檢測(cè)紅細(xì)胞A、B抗原。以紅細(xì)胞每天置室溫1h再恢復(fù)2～6℃儲(chǔ)存的模式下，F(xiàn)Hb濃度達(dá)1.0g/L，同時(shí)紅細(xì)胞血型抗原減弱達(dá)1+的最小儲(chǔ)存天數(shù)再減10d作為其使用效期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，F(xiàn)Hb檢測(cè)數(shù)據(jù)用（）表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表1、表2。

3 討論

紅細(xì)胞在體外保存過程中可發(fā)生一系列生物和毒性改變，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)其變化更加顯著，統(tǒng)稱為“紅細(xì)胞保存損傷”。包括細(xì)胞形態(tài)變化、膜結(jié)構(gòu)改變、ATP含量減少、乳酸堆積、K+的流失和Na+的聚集等，其中細(xì)胞膜帶3蛋白結(jié)構(gòu)的變化和脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)引起的氧化損傷，可導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)生裂解[6]，不但嚴(yán)重影響紅細(xì)胞血型抗原成分的穩(wěn)定性，而且使細(xì)胞內(nèi)的Hb游離出細(xì)胞外。所以測(cè)定紅細(xì)胞抗原的反應(yīng)性和上清中FHb濃度，可反映紅細(xì)胞膜的破壞情況，是評(píng)價(jià)紅細(xì)胞保存質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究通過分組設(shè)計(jì)，重點(diǎn)觀察不同保存介質(zhì)、保存溫度及保存時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞抗原及FHb的影響程度，從而確定冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的最佳保存條件及使用效期，以保證其在血型血清學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。

由表1可見，四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，上升幅度越大；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，F(xiàn)Hb達(dá)到1.0g/L的時(shí)間分別為>60、60、50、30d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為50、40、30、10d。由表2可見，四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，紅細(xì)胞血型抗原的反應(yīng)強(qiáng)度逐漸減弱；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，抗原出現(xiàn)減弱的時(shí)間越早；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達(dá)到1+的時(shí)間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為>60、60、50、20d。由此可見，冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存質(zhì)量與紅細(xì)胞的保存介質(zhì)、保存溫度和保存時(shí)間密切相關(guān)，也充分證明優(yōu)化選擇紅細(xì)胞保存條件及使用效期的重要性和必要性。

從紅細(xì)胞的保存介質(zhì)進(jìn)行分析，由于紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產(chǎn)生ATP的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生乳酸和丙酮酸等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在體內(nèi)可被其他組織氧化利用，而在體外狀態(tài)下卻因得不到充分利用而使其pH下降，而pH過低時(shí)會(huì)引起ATP從紅細(xì)胞中的釋放速率加快，導(dǎo)致紅細(xì)胞ATP耗竭，從而使紅細(xì)胞壽命走向終結(jié)[7-8]。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，在一定時(shí)間內(nèi)，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細(xì)胞提供足夠的ATP[9-11]，甘露醇則具有抵抗紅細(xì)胞溶解和加固細(xì)胞膜的作用，所以能有效維持紅細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，其保存效果明顯優(yōu)于血漿介質(zhì)。從紅細(xì)胞的保存溫度及保存時(shí)間進(jìn)行分析，因?yàn)檠菏且环N熱敏物質(zhì)，對(duì)溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細(xì)胞代謝速率越快，能量消耗越多[12-13]，隨著保存介質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗以及代謝產(chǎn)物的逐漸堆積，進(jìn)一步加重了紅細(xì)胞的儲(chǔ)存損傷，繼而使紅細(xì)胞裂解死亡。所以，紅細(xì)胞在2～6℃冰箱保存效果最好，工作中應(yīng)盡量縮短室溫放置時(shí)間，從而有效保證紅細(xì)胞的儲(chǔ)存質(zhì)量。

綜上考慮，冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后，以MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，于2～6℃冰箱中儲(chǔ)存效果最佳，工作中每天室溫使用時(shí)間應(yīng)控制在1h以內(nèi)，且時(shí)間越短，保存質(zhì)量越好。紅細(xì)胞用MAP保存液保存時(shí)，使用有效期確定為40d。該方法適用于將冰凍亞型紅細(xì)胞作為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，用于無償獻(xiàn)血者ABO血型鑒定室內(nèi)質(zhì)控時(shí)所需質(zhì)控品的制備和保存。紅細(xì)胞用血漿作為保存介質(zhì)時(shí)，使用有效期確定為20d。該方法適用于對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)供血庫(kù)進(jìn)行ABO血型鑒定質(zhì)量測(cè)評(píng)、供血庫(kù)輸血技能比武以及血型血清學(xué)培訓(xùn)等工作中所需亞型標(biāo)本的制備和保存。其他工作中如果紅細(xì)胞能在20d內(nèi)使用完畢，對(duì)懸浮介質(zhì)也無特殊要求，比如對(duì)單克隆試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)、輔助鑒定某些亞型等，則不論選擇哪一種保存方法，均能保證紅細(xì)胞的使用效果。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-06-08）endprint

[Key words] Frozen subgroup red blood cell； Melting and washing； Preservation； Quality

甘油作為最常用的細(xì)胞內(nèi)低溫保護(hù)劑，已廣泛應(yīng)用于紅細(xì)胞的低溫保存。利用該方法保存紅細(xì)胞，可使紅細(xì)胞壽命長(zhǎng)達(dá)10年，甚至延長(zhǎng)到21年[1]。我站利用該原理對(duì)日常工作中遇到的ABO亞型標(biāo)本進(jìn)行冰凍保存，并作為弱陽(yáng)性參考品對(duì)多家單克隆抗血清試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，從中挑選對(duì)亞型檢出率高的試劑用于獻(xiàn)血者血型鑒定的初、復(fù)檢，在一定程度上提高了獻(xiàn)血者的ABO亞型檢出率[2-3]。為進(jìn)一步將ABO亞型紅細(xì)胞作為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，有效應(yīng)用于獻(xiàn)血者ABO血型鑒定的室內(nèi)質(zhì)控及醫(yī)院供血庫(kù)ABO血型鑒定的質(zhì)量測(cè)評(píng)等工作中，本研究對(duì)冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存條件及使用效期進(jìn)行優(yōu)化選擇，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9%Nacl注射液、抗-A、抗-B（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；1.6%Nacl溶液（由9%和0.9%Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測(cè)定試劑盒（北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團(tuán)有限公司）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫(yī)療儀器廠）；LD5-2A型臺(tái)式離心機(jī)（北京雷勃爾公司）。

1.2 紅細(xì)胞分組和保存

從本站建立的冰凍亞型紅細(xì)胞信息庫(kù)[4]中，選擇10份儲(chǔ)存量較大、弱抗原與抗血清的反應(yīng)強(qiáng)度為2+～3+的標(biāo)本，融化洗滌后將壓積紅細(xì)胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細(xì)胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時(shí)，分別檢測(cè)四組紅細(xì)胞相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。

1.3 紅細(xì)胞質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

用鄰甲聯(lián)苯胺法檢測(cè)紅細(xì)胞上清中FHb含量；用鹽水試管法[5]檢測(cè)紅細(xì)胞A、B抗原。以紅細(xì)胞每天置室溫1h再恢復(fù)2～6℃儲(chǔ)存的模式下，F(xiàn)Hb濃度達(dá)1.0g/L，同時(shí)紅細(xì)胞血型抗原減弱達(dá)1+的最小儲(chǔ)存天數(shù)再減10d作為其使用效期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，F(xiàn)Hb檢測(cè)數(shù)據(jù)用（）表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表1、表2。

3 討論

紅細(xì)胞在體外保存過程中可發(fā)生一系列生物和毒性改變，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)其變化更加顯著，統(tǒng)稱為“紅細(xì)胞保存損傷”。包括細(xì)胞形態(tài)變化、膜結(jié)構(gòu)改變、ATP含量減少、乳酸堆積、K+的流失和Na+的聚集等，其中細(xì)胞膜帶3蛋白結(jié)構(gòu)的變化和脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)引起的氧化損傷，可導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)生裂解[6]，不但嚴(yán)重影響紅細(xì)胞血型抗原成分的穩(wěn)定性，而且使細(xì)胞內(nèi)的Hb游離出細(xì)胞外。所以測(cè)定紅細(xì)胞抗原的反應(yīng)性和上清中FHb濃度，可反映紅細(xì)胞膜的破壞情況，是評(píng)價(jià)紅細(xì)胞保存質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究通過分組設(shè)計(jì)，重點(diǎn)觀察不同保存介質(zhì)、保存溫度及保存時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞抗原及FHb的影響程度，從而確定冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的最佳保存條件及使用效期，以保證其在血型血清學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。

由表1可見，四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，上升幅度越大；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，F(xiàn)Hb達(dá)到1.0g/L的時(shí)間分別為>60、60、50、30d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為50、40、30、10d。由表2可見，四組紅細(xì)胞隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，紅細(xì)胞血型抗原的反應(yīng)強(qiáng)度逐漸減弱；室溫放置時(shí)間越長(zhǎng)，抗原出現(xiàn)減弱的時(shí)間越早；以MAP作為保存介質(zhì)，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達(dá)到1+的時(shí)間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質(zhì)，則分別為>60、60、50、20d。由此可見，冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存質(zhì)量與紅細(xì)胞的保存介質(zhì)、保存溫度和保存時(shí)間密切相關(guān)，也充分證明優(yōu)化選擇紅細(xì)胞保存條件及使用效期的重要性和必要性。

從紅細(xì)胞的保存介質(zhì)進(jìn)行分析，由于紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產(chǎn)生ATP的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生乳酸和丙酮酸等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在體內(nèi)可被其他組織氧化利用，而在體外狀態(tài)下卻因得不到充分利用而使其pH下降，而pH過低時(shí)會(huì)引起ATP從紅細(xì)胞中的釋放速率加快，導(dǎo)致紅細(xì)胞ATP耗竭，從而使紅細(xì)胞壽命走向終結(jié)[7-8]。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，在一定時(shí)間內(nèi)，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細(xì)胞提供足夠的ATP[9-11]，甘露醇則具有抵抗紅細(xì)胞溶解和加固細(xì)胞膜的作用，所以能有效維持紅細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，其保存效果明顯優(yōu)于血漿介質(zhì)。從紅細(xì)胞的保存溫度及保存時(shí)間進(jìn)行分析，因?yàn)檠菏且环N熱敏物質(zhì)，對(duì)溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細(xì)胞代謝速率越快，能量消耗越多[12-13]，隨著保存介質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗以及代謝產(chǎn)物的逐漸堆積，進(jìn)一步加重了紅細(xì)胞的儲(chǔ)存損傷，繼而使紅細(xì)胞裂解死亡。所以，紅細(xì)胞在2～6℃冰箱保存效果最好，工作中應(yīng)盡量縮短室溫放置時(shí)間，從而有效保證紅細(xì)胞的儲(chǔ)存質(zhì)量。

綜上考慮，冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后，以MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，于2～6℃冰箱中儲(chǔ)存效果最佳，工作中每天室溫使用時(shí)間應(yīng)控制在1h以內(nèi)，且時(shí)間越短，保存質(zhì)量越好。紅細(xì)胞用MAP保存液保存時(shí)，使用有效期確定為40d。該方法適用于將冰凍亞型紅細(xì)胞作為弱陽(yáng)性質(zhì)控品，用于無償獻(xiàn)血者ABO血型鑒定室內(nèi)質(zhì)控時(shí)所需質(zhì)控品的制備和保存。紅細(xì)胞用血漿作為保存介質(zhì)時(shí)，使用有效期確定為20d。該方法適用于對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)供血庫(kù)進(jìn)行ABO血型鑒定質(zhì)量測(cè)評(píng)、供血庫(kù)輸血技能比武以及血型血清學(xué)培訓(xùn)等工作中所需亞型標(biāo)本的制備和保存。其他工作中如果紅細(xì)胞能在20d內(nèi)使用完畢，對(duì)懸浮介質(zhì)也無特殊要求，比如對(duì)單克隆試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)、輔助鑒定某些亞型等，則不論選擇哪一種保存方法，均能保證紅細(xì)胞的使用效果。

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