3種不同模式匯集白膜層法制備濃縮血小板質(zhì)量和保存效果比較

王舒瑩，李曉明，劉震岳，張建民

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.輸血科；2.檢驗(yàn)科，河北承德067000）

目前，國內(nèi)傳統(tǒng)手工制備濃縮血小板（PC）方法包括富含血小板血漿法和白膜法（BC），而匯集白膜層法（PBC）手工制備PC已在歐美國家廣泛開展，且這一方法也逐漸在國內(nèi)推廣［1］。PBC制備PC又分為即時PBC法、BC室溫過夜法和全血（WB）室溫過夜法3種不同模式，后兩種模式是在即時PBC法基礎(chǔ)之上進(jìn)行改進(jìn)獲得的工藝，但這兩種模式獲得PC的質(zhì)量及保存效果與即時PBC法有無差異卻不得而知。因此，本研究中采用這3種模式PBC法制備PC并對不同模式獲得的PC質(zhì)量及保存效果進(jìn)行了比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取ABO血型均為O型志愿獻(xiàn)血者63名，所有志愿者均符合《中華人民共和國獻(xiàn)血法》健康檢查標(biāo)準(zhǔn)，其中男38例，女25例，平均（31.15±10.75）歲，志愿獻(xiàn)血者血液來源及PC制備過程均在承德市中心血站完成。依據(jù)制備PBC的3種不同模式將63名志愿獻(xiàn)血者分為：即時PBC組、BC室溫過夜組和WB室溫過夜組，每組21例，采集每名志愿獻(xiàn)血者新鮮WB 400mL。

1.2 儀器及試劑 RC－12BP大型離心機(jī)、Coulter 755全自動血細(xì)胞分析儀、流式細(xì)胞儀、熒光標(biāo)記抗血小板表面糖蛋白單克隆抗體CD62p－PE（批號：358217）及同型對照IG1－PE（批號：556372）均購于美國貝克曼庫爾特公司；TSCD－201A無菌導(dǎo)管接口機(jī)購于日本泰爾茂公司；血小板恒溫保存箱購于蘇州醫(yī)用儀器廠；PAS－ⅢM聯(lián)袋及PAS－ⅢM血小板保存液購于山東威高集團(tuán)（pH 7.2）；四聯(lián)采血袋購于日本泰爾茂公司；血小板型白細(xì)胞過濾器匯集袋購于南京雙威；血小板貯存袋購于美國Haemonetics公司；任一志愿獻(xiàn)血者的新鮮血漿（FFP）；血?dú)鈨x及血?dú)庠噭┖匈徲诿绹排啵ㄅ枺篈11824）；Th肉湯培養(yǎng)基（巰基乙酸酯培養(yǎng)基，批號12A0219）購于武漢眾一生物科學(xué)技術(shù)公司；血小板聚集誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷（ADP）購于美國sigma公司（批號：A－21169）；UNIC7200型分光光度計(jì)購于上海分析儀器廠。

表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標(biāo)比較±s，n＝7）

表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標(biāo)比較±s，n＝7）

分組血小板計(jì)數(shù)第1天 第3天 第5天 第7天紅細(xì)胞殘留量第1天 第3天 第5天 第7天陽性表達(dá)率第1天 第3天 第5天 第7天CD62p.23±7.34 30.12±8.71 38.45±10.64 42.35±9.27 BC室溫過夜組 14.96±3.18＊ 14.89±3.13＊ 14.85±3.08＊ 14.79±3.01＊ 3.18±0.63 3.07±0.59 2.94±0.63 2.82±0.60 23.89±8.65 28.97±7.89 37.96±9.46 40.78±10.34 WB室溫過夜組 15.93±2.73＃ 15.75±2.59＃ 15.68±2.47＃ 15.54±2.41＃ 3.12±0.58 3.08±0.61 2.87±0.56 2.77±0.59 24.即時PBC組 10.51±3.79 10.31±3.65 10.25±3.62 10.19±3.58 3.21±0.68 3.11±0.64 2.97±0.67 2.87±0.63 25 39±7.69 29.43±9.11 39.12±9.39 41.37±10.49

續(xù)表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標(biāo)比較±s，n＝7）

續(xù)表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標(biāo)比較±s，n＝7）

＊：P＜0.05，與即時PBC組比較；＃：P＜0.01，與即時PBC組比較。

pH值HSR血小板對ADP聚集率（%）分組能力第1天 第3天 第5天 第7天 第1天 第3天 第5天 第7天 第1天 第3天 第5天 第7天即時PBC組 66.87±8.76 55.43±8.28 50.67±7.99 44.93±8.35 7.12±0.05 7.09±0.04 7.05±0.06 7.08±0.04 84.43±11.29 67.76±10.03 31.17±6.45 21.35±5.49 BC室溫過夜組 67.34±8.42 56.38±8.39 51.17±8.18 46.08±8.09 7.08±0.03 7.11±0.05 7.09±0.04 7.04±0.06 86.49±11.87 77.14±10.76＊50.34±8.34＊39.98±7.34＊WB室溫過夜組 68.49±9.34 65.39±8.15＊59.17±8.64＊53.12±7.69＊ 6.99±0.06 7.03±0.04 7.01±0.06 7.02±0.03 84.29±11.45 68.13±10.28 34.33±6.32 23.17±4.93

1.3 方法

1.3.1 PAS－ⅢM PBC－PC的制備方法 （1）將四聯(lián)袋采集的志愿獻(xiàn)血者新鮮全血（每袋400mL）于（22±2）℃保存，以2 600r／min的轉(zhuǎn)速強(qiáng)離心13min分離出BC，熱合后與聯(lián)袋離斷；（2）將3袋檢驗(yàn)合格的BC通過無菌導(dǎo)管接口機(jī)匯集到PAS－ⅢM 聯(lián)袋中［2］，并往PAS－ⅢM 聯(lián)袋加入100mL PAS－ⅢM血小板保存液（包括沖洗裝BC的袋子所用的PAS－ⅢM）獲得PBC；（3）將PBC輕輕混合均勻后以1 500r／min離心10 min，分離出富含血小板血漿；（4）將富含血小板血漿再以600 r／min輕離心5min以除去殘留的紅細(xì)胞，至此即獲得由PBC制備出的PC；（5）將獲得PC通過血小板型白細(xì)胞過濾器過濾。即時PBC組上述過程于采集WB當(dāng)天完成；BC室溫過夜組先在第1天完成前2步分離出BC，將BC于（22±2）℃保存放置過夜，于第2天繼續(xù)后續(xù)步驟；WB室溫過夜組則將 WB于（22±2）℃保存放置過夜，第2天完成全部制備步驟。所有獲得的PC均保存在由2／3PAS－ⅢM和1／3血漿組成的保存液中，于4℃保存7d。

1.3.2 血小板及紅細(xì)胞殘留量計(jì)數(shù) 于保存期第1、3、5、7天，使用全自動血細(xì)胞分析儀對獲得的PC作血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.3 血小板聚集反應(yīng)的測定 使用任一志愿獻(xiàn)血者的新鮮貧血小板血漿將3組PC樣本中血小板濃度稀釋到250×109L－1，在250μL稀釋后血小板樣本中加入25μL ADP，再使用血小板聚集儀測定樣本中血小板對誘導(dǎo)劑ADP（濃度為20 μmol／L）的最大聚集率［3］，于保存期第1、3、5、7天各檢測1次。

1.3.4 血小板膜表面糖蛋白CD62p表達(dá)率檢測 于保存期第1、3、5、7天，參照文獻(xiàn)［4］應(yīng)用流式細(xì)胞儀對3組PC進(jìn)行血小板表面糖蛋白CD62p表達(dá)率的檢測：在兩只流式細(xì)胞儀試管中分別加入IG1－PE及CD62p－PE，隨后加入一組經(jīng)稀釋處理好的血小板樣本，混合均勻后置于避光處20min，再用1%的多聚甲醛于4℃固定，10min后用流式細(xì)胞儀檢測CD62表達(dá)率。

1.3.5 抗低滲休克（HSR）能力的測定 于保存期第1、3、5、7天，參照文獻(xiàn)［5］使用分光光度計(jì)對3組PC的HSR進(jìn)行測定。分光光度計(jì)使用波長630nm，將乏血小板血漿（PPP）調(diào)零，一只測試杯加入用蒸餾水稀釋的樣本（稀釋比例為1.0∶1.5），測最大透光率Tmax，10min后測透光率T10；另一只測試杯則加入用血漿稀釋的樣本（稀釋比例為1.0∶1.5），測透光率 TP。HSR恢復(fù)率＝（Tmax－T10）／（Tmax－TP）×100%。

1.3.6 測定pH值 使用血?dú)夥治鰞x及血?dú)庠噭┖袦y定3組PC保存期第1、3、5、7天的pH值。

1.3.7 細(xì)菌培養(yǎng) 細(xì)菌培養(yǎng)采用肉湯培養(yǎng)基，取各組樣本后進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以s表示；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果以率和構(gòu)成比表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 取各組保存期第1、3、5、7天的樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果均無細(xì)菌生長。

2.2 BC室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標(biāo)比較 與即時PBC組相比，在保存期7d內(nèi)BC室溫過夜組血小板含量均更高，且能改善血小板聚集功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而紅細(xì)胞殘留量、CD62p陽性表達(dá)率、HSR能力、pH值等指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標(biāo)比較 與即時PBC組相比，在保存期7d內(nèi)全血室溫過夜組血小板含量更高且血小板HSR能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而紅細(xì)胞殘留量、血小板聚集功能、CD62p陽性表達(dá)率、pH值等指標(biāo)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3 討 論

PBC制備PC的方法最早由Bertolini等［6］于1989年報(bào)道，既往研究報(bào)道患者在輸入此方法制備并保存12d的PC仍可使血小板計(jì)數(shù)迅速升高且出血時間縮短，而保存期間反映PC功能和質(zhì)量的指標(biāo)如HSR能力及pH值等均符合要求［7］。此外，PBC手工制備PC具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）PBC法制備的PC保存液由2／3PAS－ⅢM和1／3血漿組成，這使血漿得到了節(jié)約；（2）由于在制備過程中使用多次過濾處理去除了白細(xì)胞且保存液中血漿較少，這大大減少了患者再輸注過程中不良反應(yīng)的發(fā)生；（3）該法制備的 PC保存期可長達(dá)7d或以上［8］；（4）患者所需的治療費(fèi)用明顯降低，正是以上這些優(yōu)點(diǎn)使得PBC制備PC有廣闊的前景。但是傳統(tǒng)的即時PBC制備PC模式要求在1d內(nèi)完成血液的采集、BC分離與合格性的檢測、匯集BC制備PC以及后續(xù)的PC保存處理等多項(xiàng)工作，由于時間緊迫往往增加工作人員的夜間工作量及各采血點(diǎn)到血液中心或中心血站運(yùn)送血液頻次［9］，給制備工作帶來了很大的不便。為解決上述問題，近年來研究人員嘗試采用BC室溫過夜法和WB室溫過夜法這兩種新模式進(jìn)行PC制備，但室溫過夜是否會對PC的質(zhì)量及保存效果有所影響卻有待評價。因此，筆者嘗試依據(jù)制備PBC的3種不同模式對志愿者的血液進(jìn)行分組，以探討這3種PBC模式制備的PC質(zhì)量及保存效果有無差異。

在本研究中，與即時PBC組相比BC室溫過夜PBC組制備的PC含量更高，且能改善血小板聚集功能，而其他相關(guān)指標(biāo)卻無明顯差異。其原因可能為：剛分離出的BC，其中的白細(xì)胞和血小板極易相互黏附聚集形成微聚體，如果此時立即制備PC，由于血小板與白細(xì)胞分離不夠完全，一方面可導(dǎo)致血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀無法識別出微聚體中的血小板，從而使即時PBC模式制備出的PC含量往往較低，另一方面也導(dǎo)致血小板聚集功能大大受損。而隨著BC儲存時間的延長（如BC室溫過夜處理），由于血小板對外界刺激的敏感性降低，血小板可與白細(xì)胞分離使已形成的微聚體充分解聚，此時的血小板就可以被血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀識別從而使BC室溫過夜模式制備的PC含量增加，而制備出的PC也能重新發(fā)揮其聚集功能［10－11］。此外，最近的研究提示W(wǎng)B室溫過夜PBC法制備的PC含量可較即時PBC制備的 PC平均高出18.60%～33.00%［12－13］，與本研究結(jié)果相符，其原因可能與WB室溫放置過夜后更容易分離出血小板有關(guān)［4］。筆者還觀察到，WB室溫過夜PBC法制備的PC其HSR能力也較即時PBC法制備的PC強(qiáng)，血小板HSR能力與其在體內(nèi)的存活率密切相關(guān)［14］，制備出的血小板HSR能力越強(qiáng)，其形態(tài)與功能也就越接近正常的血小板，但WB室溫過夜PBC法制備的PC其HSR能力增強(qiáng)的原因目前尚不清楚，其機(jī)制有待進(jìn)一步地研究。

本研究中獲得的PC保存于4℃條件下，這與以往PC采取（22±2）℃保存不同，其原因在于本研究采用的是PC保存液由2／3PAS－ⅢM和1／3血漿組成，而傳統(tǒng)方法則完全使用血漿進(jìn)行PC保存。既往研究表明，在完全使用血漿保存PC時，4℃保存條件下，血小板易發(fā)生激活、凝集等現(xiàn)象，這大大減弱了血小板的功能［15］。而采用PC保存液進(jìn)行PC保存時，4℃與（22±2）℃條件下保存的PC其功能并無明顯差異［5］，即PC保存液能大大減少4℃條件下血小板發(fā)生激活、凝集的可能，因此在PC保存液中的PC于4℃條件下保存是可行的。此外，本研究涉及長期保存血小板且在研究過程中需多次檢測多項(xiàng)指標(biāo)，如PC保存于（22±2）℃條件下，將大大增加發(fā)生細(xì)菌生長的可能，所以本研究最終采取了4℃條件下保存。

總之，BC室溫過夜PBC法和WB室溫過夜PBC法均能安全、可靠、方便地制備PC，且均可代替即時PBC法制備PC。

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