一種壓阻式微懸臂梁免疫傳感器及其動(dòng)力學(xué)分析

劉志偉， 童朝陽(yáng)， 穆晞惠， 劉 冰， 郝蘭群， 張金平

(防化研究院 國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

0 引 言

微懸臂梁以其體積小、靈敏度高、不需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)受到越來(lái)越多的重視，成為近年研究熱點(diǎn)。微懸臂梁讀出方法通常包括光學(xué)和電學(xué)讀出。關(guān)于光學(xué)讀出法已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，但光學(xué)測(cè)量系統(tǒng)體積龐大、需要超真空、低溫等環(huán)境，一般局限于實(shí)驗(yàn)室生化分析[1]。壓阻式微懸臂梁是一種新型電學(xué)讀出懸臂結(jié)構(gòu)，可直接將發(fā)生在微懸臂梁表面的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)換為電阻信號(hào)變化輸出，由于壓阻式微懸臂梁讀出方式簡(jiǎn)單、易于集成、成本低、體積小，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中更具發(fā)展前景。但由于壓阻式微懸梁加工難度較大，除國(guó)外僅有幾篇應(yīng)用報(bào)道外[2～5]，國(guó)內(nèi)報(bào)道還非常少。相思子毒素(abrin)是一種劇毒生物毒素，對(duì)其進(jìn)行快速、靈敏檢測(cè)極為必要。目前利用壓阻式微懸臂梁傳感器檢測(cè)相思子毒素還未見(jiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以Abrin為作為靶標(biāo)，構(gòu)建了一種靈敏度高、響應(yīng)快速的壓阻式微懸臂梁免疫傳感器并建立了該傳感器的動(dòng)力學(xué)分析方法，為未來(lái)發(fā)展適合生物毒素現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的微小型傳感器提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Abrin和生物素化的Abrin多抗(bio-pcAb)由本實(shí)驗(yàn)室制備；活化生物素(biotin-NHS ester)、3，3，—二巰基丙酸(DDPA)、1—乙基—3—(3—二甲氨丙基)—碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N—羥基琥珀酰亞胺(NHS)、親和素(avidin)、乙醇胺均購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA，上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司)；PBS緩沖液(pH為7.4，0.01 mol/L)、雙蒸水均自備；其它所用化學(xué)品和試劑均為分析純；壓阻式微懸臂檢測(cè)平臺(tái)由本室與北京大學(xué)微電子學(xué)研究院共同搭建(圖1)(壓阻微懸臂梁傳感芯片：長(zhǎng)200 μm，寬50 μm，厚小于1 μm)。

圖1 搭建的壓阻式微懸臂梁傳感檢測(cè)平臺(tái)

1.2 基本原理

壓阻式微懸臂梁傳感檢測(cè)是基于半導(dǎo)體材料的壓阻效應(yīng)，在硅微懸臂梁上的合適區(qū)域摻雜上半導(dǎo)體材料，由于微懸臂梁表面生化反應(yīng)的發(fā)生而使微懸臂梁彎曲時(shí)，會(huì)引起摻雜區(qū)電阻的變化。因此，可以通過(guò)摻雜區(qū)電阻的變化來(lái)表征懸臂梁的偏轉(zhuǎn)。目前，顯示出較強(qiáng)壓阻效應(yīng)的材料是摻雜的單晶硅。懸臂梁上摻雜區(qū)的電阻變化可用惠斯通電橋來(lái)檢測(cè)。圖2為壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)原理示意圖。

圖2 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)原理

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Abrin多抗的生物素化

參照文獻(xiàn)[7]制備生物素標(biāo)記Abrin多抗，用間接ELISA法測(cè)定標(biāo)記前后的抗體效價(jià)。

1.3.2 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器的構(gòu)建

將芯片置于檢測(cè)池中，加入DDPA(5 g/L)，反應(yīng)1h使芯片表面金膜包被上羧基；雙蒸水清洗芯片和檢測(cè)池后加入EDC(5 g/L)和NHS(5 g/L)，反應(yīng)0.5 h，完成對(duì)微懸臂梁表面的氨基活化修飾；清洗芯片后自然晾干，滴加20 μL100 mg/L的親和素,反應(yīng)0.5 h；清洗后滴加20 μL 1 mol/L的乙醇胺反應(yīng)0.5 h以滅活金膜表面殘余的羧基；清洗后將芯片電路與檢測(cè)平臺(tái)連接并置于含PBS緩沖溶液的檢測(cè)池中，加入生物素化的Abrin多抗，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體固定過(guò)程中輸出電壓的變化，待響應(yīng)電壓穩(wěn)定后，清洗芯片及檢測(cè)池。

1.3.3 Abrin檢測(cè)

將構(gòu)建好的傳感芯片置于含0.01 mol/L PBS緩沖溶液的檢測(cè)池中，待信號(hào)穩(wěn)定后向檢測(cè)池中加入不同濃度的Abrin(一個(gè)芯片測(cè)量一個(gè)濃度)，記錄傳感器的響應(yīng)電壓變化。另以牛血清白蛋白(0.01 mol/L PBS配制)作為對(duì)照，考查傳感器的特異性。

1.3.4 免疫傳感器檢測(cè)毒素動(dòng)力學(xué)模型

抗原—抗體結(jié)合是一種典型的配體、受體結(jié)合。根據(jù)配體、受體結(jié)合的假一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[6]與壓阻式微懸臂梁電壓輸出與受力關(guān)系的特性，推導(dǎo)出壓阻式微懸臂梁電壓變化與時(shí)間之間的動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)建立的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)Abrin的實(shí)際檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)擬合方程求出傳感器對(duì)不同濃度毒素反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓變化ΔUe、響應(yīng)時(shí)間t0，分析模擬值與實(shí)測(cè)值之間的關(guān)系。

1.3.5 Abrin模擬樣品的測(cè)定

利用構(gòu)建的傳感器對(duì)Abrin終濃度為16 μg/L的水樣、土樣、牛奶等模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓變化ΔUe，并與相同濃度Abrin標(biāo)準(zhǔn)樣品的ΔUe對(duì)比，計(jì)算檢測(cè)的相對(duì)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以考查傳感器的實(shí)際應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物素化Abrin多抗效價(jià)測(cè)定

生物素標(biāo)記Abrin多抗效價(jià)約為1∶2.5×106，與標(biāo)記前的Abrin多抗效價(jià)基本相當(dāng)，表明生物素標(biāo)記對(duì)Abrin多抗活性沒(méi)有明顯的影響。

2.2 微懸臂梁免疫傳感器的構(gòu)建

加入生物素化Abrin多抗至終濃度分別為195,300 mg/L后，輸出電壓發(fā)生明顯變化，輸出信號(hào)在約20 min時(shí)基本達(dá)到飽和，輸出信號(hào)的變化量分別為5,30 μV，表明生物素化Abrin多抗已經(jīng)修飾到微懸臂梁表面，并且輸出信號(hào)隨著Abrin多抗?jié)舛鹊脑黾友杆僭龃?見(jiàn)圖3)。當(dāng)加入生物素化Abrin多抗的終濃度高于300 mg/L時(shí)，傳感器輸出電壓信號(hào)無(wú)明顯增加，因此，微懸臂梁傳感芯片上Abrin多抗固定濃度確定為300 mg/L。

圖3 固定生物素化Abrin多抗引起微懸臂梁傳感芯片輸出電壓變化實(shí)時(shí)響應(yīng)曲線

2.3 Abrin檢測(cè)

2.3.1 檢測(cè)限與特異性

用構(gòu)建好的壓阻式微懸壁梁免疫傳感器對(duì)低濃度的Abrin進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)Abrin濃度為32,16 μg/L時(shí)，輸出電壓變化信號(hào)分別為21.0,10.6 μV，當(dāng)Abrin的濃度進(jìn)一步降至8 μg/L時(shí)，輸出電壓變化信號(hào)為2.5 μV，再進(jìn)一步降低Abrin濃度，基本接近噪音信號(hào)(約0.8 μV)，因此,確定傳感器的檢測(cè)限為8 μg/L(S/N=3 dB)。整個(gè)反應(yīng)迅速達(dá)到平衡，在20 min內(nèi)完成。對(duì)照試驗(yàn)表明:加入100 μg/L的牛血清白蛋白，輸出電壓信號(hào)基本無(wú)變化，表明傳感器具有很好的特異性與抗干擾能力。

圖4 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)Abrin的實(shí)時(shí)響應(yīng)曲線

2.3.2 重現(xiàn)性

對(duì)濃度為16 μg/L的Abrin重復(fù)5次測(cè)定,ΔUe值為(11.2±1.1)μV，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.82 %，傳感器重現(xiàn)性較好。

2.4 免疫傳感器檢測(cè)毒素動(dòng)力學(xué)模型建立與分析

Abrin(A)溶液加入到固定有Abrin多抗(B)的微懸臂梁傳感芯片檢測(cè)池中，發(fā)生如下反應(yīng)，生成毒素與抗體的結(jié)合物(C)

A+BC.

(1)

在檢測(cè)池中Abrin濃度很低的情況下，可以認(rèn)為，免疫反應(yīng)發(fā)生后，溶液中Abrin (A)濃度有顯著下降，而固定化多抗(B)僅有極少數(shù)與Abrin結(jié)合，符合配體—受體結(jié)合的假一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，可假定傳感芯片上Abrin多抗?jié)舛葹橐怀?shù)(BT=K),導(dǎo)出如下公式

(2)

式中Ce為反應(yīng)達(dá)到平衡后傳感芯片上形成的抗原—抗體復(fù)合物濃度，Ct為t時(shí)刻傳感芯片上形成的抗原—抗體復(fù)合物濃度，kapp為表觀速率常數(shù)，將上式變形得

(3)

設(shè)加樣時(shí)刻壓阻微懸壁梁傳感器輸出電壓為U0，t時(shí)刻輸出電壓為Ut，此時(shí)傳感芯片上形成的抗原—抗體復(fù)合物濃度為Ct，傳感芯片表面所受的應(yīng)力為Ft。由于傳感芯片表面所受的應(yīng)力Ft直接取決于芯片表面形成的抗原—抗體復(fù)合物濃度Ct，設(shè)Ft=K1Ct(K1為常數(shù))。根據(jù)壓阻懸臂梁輸出電壓的變化與懸壁梁上所受的應(yīng)力F呈正比(比例系數(shù)為SF，對(duì)于某固定微懸臂梁，SF為一常數(shù))[7]。從而有

ΔU=Ut-U0=SFFt=SFK1Ct,

(4)

即

(5)

將上式代入式(3)得

(6)

在公式兩側(cè)同時(shí)乘以SFK1得

(7)

設(shè)ΔU=Ut-U0，ΔUe=Ue-U0(ΔU為t時(shí)刻的輸出電壓與零時(shí)刻輸出電壓之差，ΔUe為反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)刻的輸出電壓與零時(shí)刻的輸出電壓之差)，從而有

(8)

加入Abrin以后，需要一個(gè)時(shí)間傳感器才能響應(yīng)。設(shè)響應(yīng)時(shí)間為t0，則對(duì)式(8)進(jìn)行修正，可變形為

(9)

即ΔU隨時(shí)間t變化的理論模型。

根據(jù)上述建立的理論模型，對(duì)檢測(cè)Abrin的實(shí)際結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行了非線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)圖5和表1。

圖5 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)Abrin的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)動(dòng)力學(xué)擬合曲線

從表1可以看出:建立的壓阻式微懸臂梁免疫傳感器ΔU隨t變化的動(dòng)力學(xué)模型(方程式(9))能很好地與不同濃度的Abrin的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)R值均在0.971 1以上(P<0.001)，根據(jù)擬合方程求出的傳感器對(duì)不同濃度Abrin反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的響應(yīng)電壓變化ΔUe、響應(yīng)時(shí)間t0均與實(shí)測(cè)值非常接近，表明壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)Abrin遵循方程式(9)建立的動(dòng)力學(xué)模式。

表1 壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)Abrin的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)動(dòng)力學(xué)擬合分析

2.5 Abrin模擬樣品的測(cè)定

采用該傳感器對(duì)水樣、土樣、牛奶等模擬樣品進(jìn)行了測(cè)定(表2)。結(jié)果表明:對(duì)于模擬樣品的檢測(cè)，傳感器具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

表2 相思子毒素模擬樣品的測(cè)定

3 結(jié) 論

本文利用生物素—親和素放大系統(tǒng)構(gòu)建了一種壓阻式微懸壁梁免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Abrin的快速靈敏檢測(cè)，對(duì)Abrin的檢測(cè)限達(dá)到8 μg/L，反應(yīng)在20 min內(nèi)基本達(dá)到平衡，傳感器具有很好的特異性、重現(xiàn)性與抗干擾能力。建立了壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)毒素的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，根據(jù)模型方程求出Abrin檢測(cè)的平衡響應(yīng)電壓變化ΔUe、響應(yīng)時(shí)間t0等擬合值均與實(shí)測(cè)值非常接近，這為表征分析壓阻式微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)靶分子的動(dòng)力學(xué)過(guò)程提供了理論參考依據(jù)。該傳感器直接將發(fā)生在微懸臂梁表面的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)換為電阻信號(hào)變化進(jìn)行輸出，克服了傳統(tǒng)光學(xué)讀出微懸臂梁傳感器體積龐大、需要超真空、低溫等環(huán)境的缺陷，具有不需標(biāo)記、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，在生化毒素實(shí)時(shí)檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面有較大優(yōu)勢(shì)，具有很好的發(fā)展前景。

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