老鴉瓣黃酮的制備及其穩(wěn)定性研究

汪道兵，高青海，孫玉軍

（安徽科技學(xué)院 a.農(nóng)學(xué)院；b 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

0 引言

老鴉瓣（Tulipa edulis）為百合科郁金香屬草本植物，別名迎春草［1-2］。老鴉瓣的鱗莖為中藥材光慈菇，具有清熱解毒、消腫、抑菌、抗腫瘤等功效［3-4］，多用于治療痢疾、痛風(fēng)、咽喉腫痛、蛇蟲狂犬傷等［5］。自20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對光慈菇進(jìn)行了相關(guān)研究，分離得到糖類、生物堿、菲類、黃烷酮類和苷類等50 多種化合物，這些化合物表現(xiàn)出多種藥理活性，包括抗腫瘤、抗菌、降壓、抗氧化等功能［6］。在民間，夏季將老鴉瓣葉片與面條一起蒸煮以防面條變餿變味。

黃酮類化合物在中藥材中分布廣泛，是藥用植物的有效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)老鴉瓣葉片黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性［7］和抑菌活性，但關(guān)于其性質(zhì)未見報(bào)道。據(jù)此，本試驗(yàn)以老鴉瓣葉片為材料，通過提取、分離純化制備老鴉瓣黃酮，研究其穩(wěn)定性，為老鴉瓣資源的開發(fā)及其黃酮的利用提供參考。

1 材料、儀器與試劑

老鴉瓣（安徽省蒙城縣南望槐種植專業(yè)合作社饋贈(zèng)，由安徽科技學(xué)院中藥學(xué)教授劉漢珍鑒定為老鴉瓣。將老鴉瓣葉片烘干，粉碎，過100 目篩，備用。

AR2140 型電子天平（梅特勒-托利多有限公司），U-T6PC 型紫外可見分光光度計(jì)（上海屹譜儀器制造有限公司），YRE-5299 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），BSZ-100 型自動(dòng)部分收集器（上海嘉鵬科技有限公司），pH-3C 型酸度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司），PE-1730 型紅外光譜儀（美國PEAKIN-ELMER 公司）。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號LOT.NO.F20051117），D-101 型大孔樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司），蔗糖、檸檬酸、維生素C（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 老鴉瓣黃酮的制備

2.1.1 制備流程 取老鴉瓣葉片過篩粉末→加入乙醇→恒溫水浴浸提→離心→上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→D-110 大孔樹脂柱層析→收集洗脫液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→老鴉瓣黃酮。

2.1.2 老鴉瓣黃酮的提取 稱取一定量的老鴉瓣過篩粉末，按汪道兵等［7］的方法優(yōu)化得到的工藝（65%乙醇、料液比1∶20（g·mL-1）、溫度 65 ℃、浸提時(shí)間 80 min）進(jìn)行提取，提取液 4 500 r·min-1離心15 min，沉淀再浸提一次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得老鴉瓣黃酮濃縮液。

2.1.3 老鴉瓣黃酮的分離純化［8］將經(jīng)無水乙醇預(yù)處理的D-101 大孔樹脂裝柱（2.6 × 50 cm），65 %乙醇平衡3 倍柱床體積后，老鴉瓣黃酮濃縮液上樣，65%乙醇洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法［9］逐管檢測，收集含黃酮部分，合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得淡黃色固體干粉。經(jīng)溶解性能測定，發(fā)現(xiàn)老鴉瓣黃酮易溶于不同濃度的乙醇、易溶于水，這與大多數(shù)黃酮難溶于水的性質(zhì)不同。因此，老鴉瓣黃酮具有良好的醇溶性和水溶性的特點(diǎn)，應(yīng)用范圍將會(huì)更加廣泛。

2.2 老鴉瓣黃酮的鑒定

2.2.1 鹽酸鎂粉反應(yīng)［10］取適量的凍干粉于試管中，加入65%乙醇溶解，再加入少許Mg 粉搖振后滴加幾滴濃鹽酸，搖振后有紫紅色泡沫出現(xiàn)，根據(jù)特征顏色反應(yīng)，表明制備的物質(zhì)含有黃酮類化合物。

2.2.2 紫外可見光譜掃描［11］槲皮素和老鴉瓣黃酮分別采用65%乙醇溶解，按文獻(xiàn)［9］的方法加入試劑反應(yīng)后，于200 ～600 nm 波長范圍內(nèi)掃描，見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老鴉瓣黃酮（B）和槲皮素（A）的圖譜十分相似，均在372 nm 附近有吸收峰，這與文獻(xiàn)［12］報(bào)道相似，因此將372 nm 作為老鴉瓣黃酮含量的測定波長。但老鴉瓣黃酮的紫外光譜與槲皮素不完全相同，這表明老鴉瓣黃酮除含有槲皮素外還含有其他物質(zhì)。

2.2.3 紅外光譜掃描［11］分別稱取3 mg 老鴉瓣黃酮于瑪瑙研缽中，再加入100 mg KBr 粉末，研磨混勻，壓片，采用PE-1730 紅外光譜儀于波數(shù)400 ～4 000 cm-1區(qū)間掃描，見圖2。由圖2可知，老鴉瓣黃酮的主要強(qiáng)吸收峰有 3 397、2 925、2 854、1 739、1 604、1 457、1 247、1 209、1 052、588 cm-1等，其中3 397、2 925、1 604、1 052 cm-1與蘆?。?3］的官能團(tuán)相似，波數(shù)2 854、1 457、1 209、588 cm-1處的吸收峰與槲皮素［14］的官能團(tuán)相似，而波數(shù)1 739、1 247 cm-1處的吸收峰分別是糖的乙酰酯和C—H 變角振動(dòng)引起的。因此從老鴉瓣中提取得到的物質(zhì)為含有槲皮素和蘆丁等的黃酮類化合物，其部分基團(tuán)可能被糖類物質(zhì)所取代。

圖1 槲皮素（A）和老鴉瓣黃酮（B）的紫外可見掃描圖譜Fig.1 UV spectra of quercetin (A)and flavonoids from Tulipa edulis(B)

圖2 老鴉瓣黃酮的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of flavonoids from Tulipa edulis

2.3 老鴉瓣黃酮含量測定

以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，按照文獻(xiàn)［9］操作方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y= 1.072 9X+0.002 1，Y表示吸光度，X表示槲皮素的含量，R2= 0.999 8。按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作測得老鴉瓣黃酮的含量為63.09%。

2.4 老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性考察

2.4.1 溫度對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，分別置于25、35、45、55、65、75、85、95 ℃的恒溫水浴鍋中避光恒溫1 h，然后取出冷卻至室溫，按文獻(xiàn)［9］的方法加入試劑反應(yīng)后，于372 nm 波長下測定吸光度（根據(jù)紫外可見掃描圖譜，確定以A372值來表示黃酮相對含量的多少，下同），考察溫度對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響，見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25 ～85 ℃溫度范圍內(nèi)，老鴉瓣黃酮的A372值變化不大（P＞ 0.05），當(dāng)溫度大于 85 ℃時(shí)，A372突然增大，影響顯著（P＜ 0.05），其原因可能是溫度過高破壞了老鴉瓣黃酮的分子結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更多的酚羥基導(dǎo)致的。這和王麗娟等［14］研究溫度對黑苦蕎黃酮穩(wěn)定性的結(jié)果相似。因此，老鴉瓣黃酮應(yīng)在低于85 ℃的條件下保存或者使用。

圖3 溫度對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.2 pH 對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，調(diào)pH 值依次為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，靜置30 min 后，按文獻(xiàn)［9］的方法方法加入試劑反應(yīng)后，于372 nm 波長下測定吸光度，考察pH 對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響，見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老鴉瓣黃酮水溶液A372值在pH 4 ～7 之間時(shí)變化不大（P＞0.05），黃酮類化合物因分子中含有多個(gè)酚羥基，一般呈弱酸性，在此范圍內(nèi)老鴉瓣黃酮較為穩(wěn)定。在強(qiáng)酸或偏堿環(huán)境中老鴉瓣黃酮的穩(wěn)定性較差（P＜0.05），因此老鴉瓣黃酮不宜在強(qiáng)酸或偏堿的環(huán)境中保存或使用。

圖4 pH 對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.3 氧化劑H2O2對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，添加H2O2，使每管中的H2O2濃度依次為0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%（根據(jù)食品行業(yè)規(guī)定，食品中H2O2的允許含量不超過2%［15］），搖勻后在室溫下靜置1 h，按文獻(xiàn)［9］的方法加入試劑反應(yīng)后，于372 nm波長下測定吸光度，考察氧化劑H2O2對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響，見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的不斷增大，老鴉瓣黃酮水溶液的A372值隨之升高，但升高不顯著（P＞0.05），表明氧化劑H2O2對老鴉瓣黃酮水溶液穩(wěn)定性影響不大，進(jìn)而說明了老鴉瓣黃酮具有良好的抗氧化活性［16］。

2.4.4 還原劑Na2SO3對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響 于每支試管中加入1 g/L老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，添加Na2SO3，使每管中的Na2SO3濃度依次為0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%（根據(jù)食品行業(yè)規(guī)定，食品中Na2SO3的允許含量不超過0.05%［15］），搖勻后在室溫下靜置1 h，按文獻(xiàn)［9］的方法加入試劑反應(yīng)后，于372 nm 波長下測定吸光度，考察還原劑Na2SO3對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響，見圖6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Na2SO3濃度的不斷增大，老鴉瓣黃酮水溶液的A372呈下降趨勢，表明還原劑Na2SO3對老鴉瓣黃酮的穩(wěn)定性有較大影響（P＜0.05），使其發(fā)生了化學(xué)變化。因此，老鴉瓣黃酮在保存或使用時(shí)需要避免接觸此類物質(zhì)。

圖5 H2O2對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of H2O2 on stability of flavonoids from Tulipa edulis

圖6 Na2SO3對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of Na2SO3 on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.5 光照對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，分別在密閉和自然光照射下放置，于0、1、2、3、4、5 d 時(shí)定時(shí)取樣，按文獻(xiàn)［9］的方法加入試劑反應(yīng)后，于372 nm 波長下測定吸光度，研究光照對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響，見圖7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間的延長，老鴉瓣黃酮水溶液的A372值逐漸下降，且下降趨勢為自然光大于避光條件，但均不顯著（P＞0.05），表明光照或者避光條件對老鴉瓣黃酮的穩(wěn)定性影響不大。相比之下，在避光條件下老鴉瓣黃酮的穩(wěn)定性稍高。

圖7 光照對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of illumination on stability of flavonoids from Tulipa edulis

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以老鴉瓣葉片為原料，65%乙醇為提取劑提取老鴉瓣粗黃酮，并采用D-101 大孔樹脂柱層析法對老鴉瓣黃酮進(jìn)行分離純化。該提取和純化方法操作方便，成本低廉，適合于老鴉瓣黃酮的制備。

天然類黃酮化合物具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、防腐保鮮等功效，但諸多功效均受到其穩(wěn)定性的影響。在不同的條件下，黃酮的穩(wěn)定性具有一定的差異。本試驗(yàn)研究了氧化劑H2O2、還原劑Na2SO3、光照、溫度、pH 值等因素對老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性的影響，其中Na2SO3對黃酮的穩(wěn)定性影響顯著（P＜0.05），而溫度（＜85 ℃）、氧化劑H2O2、pH 4 ～7 的酸性條件以及在自然光或避光條件對黃酮的穩(wěn)定性影響不大（P＞0.05）?？傊谠囼?yàn)范圍內(nèi)，老鴉瓣黃酮穩(wěn)定性較高。另外本課題組研究發(fā)現(xiàn)，老鴉瓣黃酮具有體外抗氧化活性［7］，還具有良好的抑菌活性，因此，老鴉瓣黃酮具有一定的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。