油菜素甾醇信號(hào)通路中BKI1互作蛋白ERD7的篩選與鑒定

程 鱗，張 弛，蔣建軍，蘇 偉，王學(xué)路

(1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物科學(xué)研究所，上海200433;2.復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200433)

油菜素甾醇(Brassinosteroid，BR)是一類重要的植物激素，廣泛存在于植物的大部分組織器官中.在擬南芥中進(jìn)行的遺傳學(xué)研究揭示了BR在植物生長發(fā)育中具有重要的地位，它調(diào)控了植物生長發(fā)育的各個(gè)方面，包括莖的伸長、維管組織的分化、光形態(tài)建成、種子的萌發(fā)、植物的育性、衰老以及對(duì)多種生物和非生物脅迫的反應(yīng)等［1］.

1997年通過對(duì)BR不敏感突變體的篩選，鑒定到BR的細(xì)胞膜受體BRI1(Brassinosteroid Insensitive 1)［2］，它編碼一個(gè)富含亮氨酸的類受體激酶(LRR-RLK)，具有絲蘇氨酸和酪氨酸自磷酸化活性［3-5］，BRI1含有一個(gè)感知BR信號(hào)的胞外結(jié)構(gòu)域［6］、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)傳遞信號(hào)至下游組分胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［7］.目前已發(fā)現(xiàn)受體BRI1的活性還受到其他蛋白的調(diào)節(jié).當(dāng)BR與BRI1的胞外域相結(jié)合后，BRI1與其共受體BAK1(BRI1-Associated Receptor Kinase 1)相互作用，形成異源二聚體，同時(shí)BRI1和BAK1發(fā)生自磷酸化或相互磷酸化，將信號(hào)傳遞到下游組分［8-9］.此外，BKI1(BRI1 Kinase Inhibitor 1)作為BR信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在沒有BR信號(hào)的時(shí)候，與BRI1結(jié)合抑制BRI1的磷酸化活性.

使用BRI1進(jìn)行酵母雙雜交篩選，顯示BRI1能夠與BKI1相互作用.沒有BR信號(hào)時(shí)，BKI1定位于細(xì)胞膜上，能夠與BRI1相互結(jié)合，這種結(jié)合能競(jìng)爭(zhēng)性抑制BRI1與BAK1的結(jié)合，從而抑制BRI1-BAK1受體復(fù)合體的激活過程.遺傳學(xué)分析顯示，BKI1過表達(dá)植株表現(xiàn)為矮小，表明BKI1對(duì)BR信號(hào)傳遞有負(fù)調(diào)控的功能［10-11］.當(dāng)BR與BRI1結(jié)合后，BKI1迅速從膜上解離，進(jìn)入胞質(zhì)，解除對(duì)BRI1的抑制作用［10］.在這個(gè)過程中，BKI1作為BRI1的底物，能夠被BRI1磷酸化，磷酸化位點(diǎn)為Ser-270，Ser-274和Tyr-211［11］.其中BKI1的C末端Ser-270，Ser-274兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化能促使BKI1從細(xì)胞膜上解離到細(xì)胞質(zhì)中［12］.BKI1的C末端由20個(gè)氨基酸(306～325)組成，它們是介導(dǎo)BKI1與BRI1相互作用的關(guān)鍵序列［11，13］.但是，在BKI1過表達(dá)植株中，表達(dá)量較低的植株與表達(dá)量較高的植株相比，植株變大、下胚軸變長.對(duì)這一現(xiàn)象的深入研究表明，磷酸化的BKI1能與14-3-3蛋白相互作用，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制14-3-3與BES1的結(jié)合，促進(jìn)BES1的去磷酸化，行使正調(diào)控BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能［12］.因此，BKI1在BR信號(hào)通路中起到正負(fù)調(diào)控的雙重作用.

擬南芥中的ERD7蛋白含有一個(gè)衰老結(jié)構(gòu)域，被歸為一類衰老相關(guān)蛋白.ERD7基因最早通過差異雜交的方法被鑒定，其表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo)［14］，之后通過microarray技術(shù)發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)受到多種因素的影響.在冷、強(qiáng)光、高鹽等處理下，ERD7的表達(dá)量會(huì)增加［15-17］.在檢測(cè)擬南芥對(duì)砷脅迫的反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)ERD7等4個(gè)與衰老相關(guān)的基因在砷脅迫下表達(dá)量下調(diào)［18］.在一個(gè)對(duì)蔗糖和滲透劑敏感的擬南芥sweetie突變體里，ERD7等7個(gè)與衰老相關(guān)的基因表達(dá)量上調(diào)，sweetie突變體還表現(xiàn)出葉片、萼片、花瓣衰老加速的表型［19］.多種植物激素都參與到擬南芥對(duì)脅迫的響應(yīng)，ERD7的表達(dá)也受到幾種激素的調(diào)節(jié).基因芯片數(shù)據(jù)和基因組分析結(jié)果表明ERD7的表達(dá)在BL處理和ABA處理時(shí)發(fā)生上調(diào)［20-22］.施加GA使ERD7的表達(dá)量下調(diào)，而同時(shí)施加放線酮(cycloheximide)和地塞米松(dexamethasone)使GA信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子DELLA家族中RGA的含量提高后，ERD7的表達(dá)量上調(diào)［23］.但ERD7的表達(dá)不受IAA 處理的影響［20］.

BKI1作為BR信號(hào)通路中一個(gè)重要的組成成分，BKI1通過亞細(xì)胞定位改變與BES1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合14-3-3等機(jī)制來調(diào)節(jié)BR信號(hào)通路.對(duì)于BKI1自身的調(diào)節(jié)目前研究主要集中于BRI1對(duì)BKI1的磷酸化，BKI1是否還受到其他蛋白的調(diào)控是一個(gè)值得探索的新課題.為了研究BKI1自身的調(diào)控機(jī)制，我們使用BKI1作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交篩選擬南芥cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了新的與BKI1相互作用蛋白—ERD7，它們的互作通過半體內(nèi)pull-down的方法得到進(jìn)一步驗(yàn)證.在細(xì)胞學(xué)上，我們證明BKI1與ERD7能夠共定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上.

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)，煙草(Nicotiana benthamiana)，轉(zhuǎn)基因擬南芥BKI1-FLAG，大腸桿菌克隆菌株Escherichia coli DH5α和表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)，酵母菌株Saccharomy cescerevisiae AH109和Y187，根癌農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium tumefaciens GV3101，酵母表達(dá)載體pGBKT7和pGADT7;煙草中瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA-2302和pCAMBIA-mCherry，大腸桿菌中蛋白表達(dá)載體pGEX4T-1均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

植物生長培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基):2.2 g/L MS粉，0.8% 瓊脂粉，pH5.6～6.0，向其中添加80μg/mL Kanamycin可用于抗性篩選.大腸桿菌完全培養(yǎng)基:LB 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，向其中添加100μg/mL Kanamycin或100μg/mL Ampicillin可用于抗性篩選.酵母培養(yǎng)基YPDA:2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母提取物，30μg/mL Adenine.酵母營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD-):0.67%無氨基酵母氮源，2%葡萄糖，5.5 g/L dropout mix(-His、-Trp、-Leu、-Ade)，根據(jù)需要加入 20 μg/mL His、Trp、Leu或Ade選擇不同缺陷型菌株.向以上細(xì)菌培養(yǎng)基加入1%瓊脂粉、酵母培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉配制相應(yīng)固體培養(yǎng)基.

1.2 方法

1.2.1 酵母雙雜交篩選

將BKI1構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGBKT7中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入AH109菌株.從Clontech購買了擬南芥cDNA文庫(Clontech Cat.No.630487)，該文庫cDNA由擬南芥的幼苗、花、芽、花粉、莢果、葉片、莖等11個(gè)組織中提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來.將cDNA文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)入Y187酵母菌株中，AH109菌株和Y187菌株雜交，在酵母SD/-Leu-Trp，SD/-His-Leu-Trp和SD/-Ade-His-Leu-Trp缺陷型營養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性克隆篩選.

1.2.2 基因和蛋白質(zhì)序列分析

在TAIR網(wǎng)站(http:∥www.arabidopsis.org/)查找擬南芥基因序列及結(jié)構(gòu)，并在 NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找 ERD7在其他物種中的同源基因序列，在 Mobyle網(wǎng)站(http:∥mobyle.pasteur.fr/)進(jìn)行序列比對(duì).在 PRED 網(wǎng)站(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對(duì)ERD7蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，在SMART網(wǎng)站(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè).

1.2.3 GST-ERD7融合蛋白的體外表達(dá)及純化

37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌表達(dá)菌株4 mL，然后再在250 mL培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1.0左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，25℃培養(yǎng)5 h，收菌，向菌體中加入GST蛋白結(jié)合緩沖液20 mL，將菌體懸浮混勻，加入溶菌酶1 mg/mL，混勻后冰上放置30 min.超聲破碎15 min，超聲條件為超聲5 s停12 s.超聲結(jié)束后，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清.重復(fù)離心一次.根據(jù)收集到的菌體的量取適量的GST瓊脂糖珠子，加入1 mL GST結(jié)合緩沖液，混勻后，1 000 r/min，4℃，離心3 min.重復(fù)3次.將蛋白上清液加入活化后的GST珠子中，4℃結(jié)合2～3 h.1 000 r/min，4℃，離心3 min，去上清.用結(jié)合緩沖液洗GST珠子5～6次，去上清.加入GST洗脫緩沖液400μL，4℃洗脫1 h，離心取上清，即為純化后的GST融合蛋白.分裝后-80℃保存.

1.2.4 半體內(nèi)GST pull-down分析

將結(jié)合有GST融合蛋白的瓊脂糖珠子懸浮在100μL GST結(jié)合緩沖液中備用.取2 g植物材料，在液氮中研磨，加入植物活性蛋白提取緩沖液1 mL，4℃靜音混勻30 min.12 000 r/min，10 min離心，取上清.將懸浮著結(jié)合GST融合蛋白的珠子加入植物蛋白液中，靜音混勻2 h.1 000 r/min離心，去上清，重復(fù)3次.加入40μL的1×SDS上樣緩沖液，95℃變性5 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過Western blot使用Anti-Flag抗體檢測(cè)植物材料中目標(biāo)蛋白.

1.2.5 在煙草葉片細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)蛋白及蛋白定位觀察

構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA-2302-BKI1，pCAMBIA-ERD7-mCherry，同時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入煙草葉片下表皮細(xì)胞，使之同時(shí)表達(dá)BKI1-GFP蛋白和ERD7-mCherry蛋白.用熒光共聚焦顯微鏡Laser Scanning Confocal Microscope分別觀察GFP和mCherry熒光蛋白的信號(hào)，對(duì)BKI1和ERD7蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位.

2 結(jié)果與分析

2.1 BKI1相互作用蛋白的篩選

為了尋找BR信號(hào)通路的新的組分，我們通過酵母雙雜交方法篩選與BKI1相互作用的蛋白.BKI1基因全長序列被構(gòu)建進(jìn)入pGBKT7載體上，在釀酒酵母中表達(dá)融合DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain，BD)的BD-BKI1融合蛋白，形成誘餌蛋白，轉(zhuǎn)化進(jìn)入AH109酵母菌株中.

通過酵母雙雜交篩選擬南芥cDNA文庫，我們獲得了298個(gè)能在SD/-His-Leu-Trp篩選培養(yǎng)基上生長的獨(dú)立單菌落，其中136個(gè)能在SD/-Ade-His-Leu-Trp篩選培養(yǎng)上繼續(xù)生長.利用菌落PCR的方法，克隆得到每個(gè)單菌落中包含的擬南芥cDNA序列，并測(cè)序分析.進(jìn)一步將測(cè)序結(jié)果與擬南芥全基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中26個(gè)單菌落中包含的序列在擬南芥基因組的讀碼框中編碼蛋白質(zhì).選擇其中與BD-BKI1相互作用最強(qiáng)的第32號(hào)單克隆對(duì)應(yīng)的cDNA進(jìn)行進(jìn)一步研究.

從32號(hào)單克隆中擴(kuò)增的核酸序列PCR產(chǎn)物與Tair數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的AT2G17840基因核酸序列相似，32號(hào)基因編碼了AT2G17840基因中的第1～244個(gè)氨基酸殘基.這表明AT2G17840基因編碼的蛋白質(zhì)N端與BKI1相互作用.進(jìn)一步檢測(cè)了全長ERD7蛋白與BKI1之間的相互作用(圖1).

2.2 ERD7基因和蛋白序列分析

根據(jù)TAIR網(wǎng)站上的信息，ERD7基因序列全長1 359 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成.編碼了452個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為49 ku，等電點(diǎn)為5.079.使用ERD7蛋白質(zhì)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中不同物種間的序列進(jìn)行比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)ERD7是一個(gè)在植物中特異表達(dá)的基因.ERD7與雙子葉植物蓖麻(Ricinus communis)、大豆(Glycine max)的ERD7序列的相似性分別為69%和66%，與單子葉植物玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa Japonica Group)的相似性均為46%，ERD7在低等植物小立碗蘚(Physcomitrella patens subsp.Patens)中也有同源基因，它們的相似性為37%(圖2).

圖1 酵母雙雜交篩選獲得與BKI1相互作用的ERD7Fig.1 ERD7 was obtained by yeast two hybrid screening

通過Position Specific Iterated PRED對(duì)擬南芥ERD7蛋白的二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ERD7蛋白有2個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域(Low Complex Region)，一個(gè)富含β折疊的區(qū)域，一個(gè)富含α-螺旋的區(qū)域.通過SMART預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ERD7蛋白包含一個(gè)衰老結(jié)構(gòu)域(Senescence Domain，PF06911)，這個(gè)結(jié)構(gòu)域由約450個(gè)氨基酸殘基組成，最早發(fā)現(xiàn)于萱草(Hemerocallishybrid).萱草的花瓣存在一種有遺傳基礎(chǔ)的程序，在開花約24 h以內(nèi)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)衰老和死亡，人們認(rèn)為在這個(gè)過程中表達(dá)產(chǎn)生的衰老相關(guān)蛋白與這個(gè)過程有重要關(guān)系［24］.衰老結(jié)構(gòu)域還在許多Spartin蛋白中被發(fā)現(xiàn)，這可能表明它在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、微管的動(dòng)態(tài)平衡方面發(fā)揮作用［25］.

圖2 ERD7序列的比對(duì)分析Fig.2 Alignment analysis of ERD7

2.3 全長ERD7和BKI1在酵母中的相互作用驗(yàn)證

在酵母雙雜交篩選中我們獲悉了ERD7的N端與BKI1相互作用，為了驗(yàn)證全長ERD7與BKI1的相互作用關(guān)系，我們首先使用PCR方法從擬南芥總cDNA中擴(kuò)增獲得全長ERD7基因，并克隆到pGADT7載體上，使之在酵母中表達(dá)ERD7與激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain，AD)融合的AD-ERD7重組蛋白.進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn).如圖3所示，在酵母中，全長AD-ERD7與BD-BKI1能夠生長于SD/-His-Leu-Trp的酵母缺陷培養(yǎng)基上，而AD與BD-BKI1和AD-ERD7與BD對(duì)照組不能生長，因此，結(jié)果說明AD-ERD7與BDBKI1能夠在酵母中發(fā)生穩(wěn)定的相互作用.

2.4 ERD7與BKI1在植物體內(nèi)的相互作用驗(yàn)證

將全長ERD7基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T-1上，在大腸桿菌BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)ERD7與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Gultathione STransferases，GST)融合的重組蛋白GST-ERD7.經(jīng)過純化，如圖4(a)所示，我們得到約74 ku的蛋白條帶，這與預(yù)測(cè)的ERD7蛋白的分子質(zhì)量相似.

提取BKI1-FLAG過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的總蛋白，與珠子相連的純化后GST-ERD7或GST蛋白分別與BKI1-FLAG轉(zhuǎn)基因植株蛋白提取液共孵育，洗去非特異性結(jié)合蛋白.最后，使用FLAG抗體在Western blot中檢測(cè)與GST-ERD7或GST特異性結(jié)合的蛋白.結(jié)果表明FLAG抗體在與GST-ERD7孵育的樣品中檢測(cè)到與提取液中一致的BKI1-FLAG條帶，而與GST蛋白孵育的樣品中沒有雜交條帶.這一結(jié)果說明在半體內(nèi)環(huán)境下，ERD7與BKI1能夠發(fā)生相互作用(圖4(b)).

圖4 ERD7蛋白的表達(dá)和半體內(nèi)pull-down分析Fig.4 Protein purification of recombinant GST-ERD7 and semi-in-vivo pull-down assay

2.5 ERD7的亞細(xì)胞定位及與BKI1的共定位

為了在細(xì)胞學(xué)水平研究在植物體內(nèi)ERD7與BKI1是否具有相似的亞細(xì)胞定位，我們首先構(gòu)建了紅色熒光蛋白mCherry與ERD7的C端融合為mCherry-ERD7和綠色熒光蛋白GFP與BKI1的C端融合為BKI1-GFP的植物表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將它們共同轉(zhuǎn)染煙草細(xì)胞，我們通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，mCherry-ERD7的熒光信號(hào)能夠在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中被檢測(cè)，BKI1-GFP蛋白也在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá).將兩個(gè)蛋白信號(hào)疊加發(fā)現(xiàn)mCherry-ERD7和BKI1-GFP蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上能夠共定位(圖5).說明兩者在體內(nèi)發(fā)揮功能的場(chǎng)所是一致的，在細(xì)胞水平上說明mCherry-ERD7和BKI1-GFP可能發(fā)生相互作用.

圖5 ERD7與BKI1在煙草細(xì)胞中的的亞細(xì)胞定位Fig.5 Sub-cellular localization of ERD7 and BKI1 in tobacco cell

3 討論

本研究通過酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)ERD7與BKI1之間的相互作用，對(duì)于拓展BKI1的調(diào)控機(jī)制及探尋BR信號(hào)途徑的新成分有重要作用.BR含量低時(shí)，BKI1主要定位于細(xì)胞膜上抑制BR信號(hào)通路，BR與BRI1結(jié)合后，BKI1從細(xì)胞膜上解離，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并發(fā)揮新的正調(diào)控功能.ERD7蛋白與BKI1有共同的亞細(xì)胞定位，說明ERD7很可能在BKI1的定位變化過程中起到調(diào)控作用.與BKI1類似，ERD7在擬南芥全株廣譜表達(dá)(e-FP Browser，數(shù)據(jù)未出示)，這可能適應(yīng)于它通過調(diào)節(jié)BKI1來影響B(tài)R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥的生長發(fā)育.其中，在莢果和種子中ERD7的表達(dá)量較高，說明ERD7對(duì)于莢果和種子的發(fā)育可能起到重要作用.BKI1過表達(dá)植株表現(xiàn)出莢果角向下的表型［10］，是BR信號(hào)中其他突變體所不具有的特征，ERD7在莢果中的高表達(dá)暗示著ERD7很可能參與到BKI1調(diào)控莢果角的發(fā)育這一過程中.ERD7包含有一個(gè)衰老結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在多種植物中被報(bào)道與衰老相關(guān)［26-28］，在衰老過程中表達(dá)上調(diào).BR的合成突變體和受體突變體均表現(xiàn)為衰老延遲，說明BR信號(hào)起著促進(jìn)擬南芥衰老的作用［2，29］.因此，ERD7與BR信號(hào)通路元件在調(diào)節(jié)植物的衰老過程方面具有相似性.

植物通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)來適應(yīng)環(huán)境，包括激素的合成和運(yùn)輸，大量相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控等.BR信號(hào)在植物對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)中起著重要作用，如干旱、高鹽等［30］.BR信號(hào)對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)還往往是通過與其他植物激素的相互作用，如ABA、GA、乙烯、水楊酸等實(shí)現(xiàn)的［31-33］.ERD7的表達(dá)受到多種環(huán)境脅迫的影響，干旱、冷害、強(qiáng)光、及高鹽逆境因子都能誘導(dǎo)其表達(dá)，表明ERD7在提高植物的抗逆性上有廣泛的作用.ERD7的表達(dá)還受到BL和ABA的誘導(dǎo)以及GA的抑制.ERD7在擬南芥中廣泛表達(dá)，對(duì)多種逆境和植物激素響應(yīng)，與BR對(duì)擬南芥的生長發(fā)育的調(diào)控有極大相關(guān)性，ERD7與BKI1相互作用的發(fā)現(xiàn)對(duì)探索ERD7對(duì)BKI1的調(diào)控及對(duì)BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響有重要意義.

［1］Yang C J，Zhang C，Lu Y N，et al.The mechanisms of brassinosteroids'action:From signal transduction to plant development［J］.Molecular plant，2011，4(4):588-600.

［2］Li J，Chory J.A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction［J］.Cell，1997，90(5):929-938.

［3］Friedrichsen D M，Joazeiro CA P，Li J，et al.Brassinosteroid-insensitive-1 is a ubiquitously expressed leucinerich repeat receptor serine/threonine kinase［J］.Plant Physiology，2000，123(4):1247-1256.

［4］Wang X，Goshe M B，Soderblom E J，et al.Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase［J］.The Plant Cell，2005，17(6):1685-1703.

［5］Oh M H，Wang X，Kota U，et al.Tyrosine phosphorylation of the BRI1 receptor kinase emerges as a component of brassinosteroid signaling in Arabidopsis［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(2):658-663.

［6］He Z，Wang Z Y，Li J，et al.Perception of brassinosteroids by the extracellular domain of the receptor kinase BRI1［J］.Science Signaling，2000，288(5475):2360.

［7］Wang X，Li X，Meisenhelder J，et al.Autoregulation and homodimerization are involved in the activation of the plant steroid receptor BRI1［J］.Developmental Cell，2005，8(6):855-865.

［8］Nam K H，Li J.BRI1/BAK1，a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling［J］.Cell，2002，110(2):203.

［9］Li J.Brassinosteroids signal through two receptor-like kinases［J］.Current Opinion in Plant Biology，2003，6(5):494-499.

［10］Wang X，Chory J.Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1，a negative regulator of BRI1 signaling，from the plasma membrane［J］.Science Signaling，2006，313(5790):1118.

［11］Jaillais Y，Hothorn M，Belkhadir Y，et al.Tyrosine phosphorylation controls brassinosteroid receptor activation by triggering membrane release of its kinase inhibitor［J］.Science Signaling，2011，25(3):232.

［12］Wang H，Yang C，Zhang C，et al.Dual role of BKI1 and 14-3-3s in brassinosteroid signaling to link receptor with transcription factors［J］.Developmental Cell，2011，21(5):825-834.

［13］Guan Y，Wang H，Wang X.Identification and preliminary study of the minimum motif for BKI1 interacting with BRI1［J］.J Fudan Univ，2011，50(3):320-327.

［14］Kiyosue T，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Cloning of cDNAs for genes that are early-responsive to dehydration stress(ERDs)in Arabidopsis thaliana L.:Identification of three ERDs as HSPcognate genes［J］.Plant Molecular Biology，1994，25(5):791-798.

［15］Seki M，Narusaka M，Ishida J，et al.Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought，cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray［J］.The Plant Journal，2002，31(3):279-292.

［16］Kimura M，Yamamoto Y Y，Seki M，et al.Identification of Arabidopsis genes regulated by high light-stress using cDNA microarray［J］.Photochemistry and Photobiology，2003，77(2):226-233.

［17］Oono Y，Seki M，Satou M，et al.Monitoring expression profiles of Arabidopsis genes during cold acclimation and deacclimation using DNA microarrays［J］.Functional＆ Integrative Genomics，2006，6(3):212-234.

［18］Abercrombie J，Halfhill M，Ranjan P，et al.Transcriptional responses of Arabidopsis thaliana plants to As(V)stress［J］.BMC Plant Biology，2008，8(1):87.

［19］Veyres N，Danon A，Aono M，et al.The Arabidopsis sweetie mutant is affected in carbohydrate metabolism and defective in the control of growth，development and senescence［J］.The Plant Journal，2008，55(4):665-686.

［20］Goda H，Sawa S，Asami T，et al.Comprehensive comparison of auxin-regulated and brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2004，134(4):1555-1573.

［21］Sánchez J P，Duque P，Chua N H.ABA activates ADPR cyclase and cADPR induces a subset of ABA-responsive genes in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，2004，38(3):381-395.

［22］Mizuno T，Yamashino T.Comparative transcriptome of diurnally oscillating genes and hormone-responsive genes in Arabidopsis thaliana:Insight into circadian clock-controlled daily responses to common ambient stresses in plants［J］.Plant and Cell Physiology，2008，49(3):481-487.

［23］Hou X，Hu W W，Shen L，et al.Global identification of DELLA target genes during Arabidopsis flower development［J］.Plant Physiology，2008，147(3):1126-1142.

［24］Panavas T，Pikula A，Reid P D，et al.Identification of senescence-associated genes from daylily petals［J］.Plant Molecular Biology，1999，40(2):237-248.

［25］Ciccarelli F D，Proukakis C，Patel H，et al.The identification of a conserved domain in both spartin and spastin，mutated in hereditary spastic paraplegia［J］.Genomics，2003，81(4):437-441.

［26］Smart C M，Hosken S E，Thomas H，et al.The timing of maize leaf senescence and characterization of senescence-related cDNAs［J］.Physiologia Plantarum，1995，93(4):673-682.

［27］John I，Hackett R，Cooper W，et al.Cloning and characterization of tomato leaf senescence-related cDNAs［J］.Plant Molecular Biology，1997，33(4):641-651.

［28］Buchanan-Wollaston V，Ainsworth C.Leaf senescence in Brassica napus:Cloning of senescence related genes by subtractive hybridisation［J］.Plant Molecular Biology，1997，33(5):821-834.

［29］Choe S，Dilkes B P，Gregory B D，et al.The Arabidopsis dwarf1 mutant is defective in the conversion of 24-methylenecholesterol to campesterol in brassinosteroid biosynthesis［J］.Plant Physiology，1999，119(3):897-908.

［30］Kagale S，Divi U K，Krochko J E，et al.Brassinosteroid confers tolerance in Arabidopsis thaliana and Brassica napus to a range of abiotic stresses［J］.Planta，2007，225(2):353-364.

［31］Zhang S，Cai Z，Wang X.The primary signaling outputs of brassinosteroids are regulated by abscisic acid signaling［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(11):4543-4548.

［32］Wang L，Wang Z，Xu Y，et al.OsGSR1 is involved in crosstalk between gibberellins and brassinosteroids in rice［J］.The Plant Journal，2009，57(3):498-510.

［33］Divi U K，Rahman T，Krishna P.Brassinosteroid-mediated stress tolerance in Arabidopsis shows interactions with abscisic acid，ethylene and salicylic acid pathways［J］.BMCPlant Biology，2010，10(1):151.