肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與表皮生長(zhǎng)因子聯(lián)合培養(yǎng)人膽囊上皮細(xì)胞的研究＊

鄧世康，袁 珺，王連敏，王 滔，鄒 浩，張小文

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科二病區(qū)，昆明 650101）

膽囊上皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞一樣，是一種高氧耗、高代謝、低缺氧耐受的細(xì)胞群體，由于膽囊上皮細(xì)胞這些特殊的生物學(xué)特征，使其體外培養(yǎng)很困難。通過(guò)創(chuàng)新培養(yǎng)方法后成功培養(yǎng)出了人膽囊上皮細(xì)胞（human gallbladder epithelial cells，HGBECs），不僅能使其存活時(shí)間延長(zhǎng)，還能維持其生物學(xué)特征。膽囊結(jié)石、膽囊息肉和膽囊癌等膽囊疾病的發(fā)病都與膽囊上皮細(xì)胞密切相關(guān)，研究膽囊上皮細(xì)胞，可以更為準(zhǔn)確了解膽囊疾病乃至膽管疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人膽囊標(biāo)本 標(biāo)本來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科二病區(qū)經(jīng)手術(shù)治療膽囊息肉的患者，并且經(jīng)院倫理委員會(huì)及患者同意。

1.1.2 試劑（1）完全培養(yǎng)基Ⅰ：DMEM／F12培養(yǎng)基（Hyclon公司）中加入20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco公司），1%青／鏈霉素（雙抗）（索萊寶公司）。（2）完全培養(yǎng)基Ⅱ：DMEM／F12培養(yǎng)基中加入10ng／mL表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF，PeproTech公司），20%FBS，1%雙抗。（3）完全培養(yǎng)基Ⅲ：DMEM／F12培養(yǎng)基中加入10ng／mL EGF（PeproTeeh公司），10ng／mL 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF，PeproTech公司），20%FBS，1%雙抗。Ⅳ型膠原酶（索萊寶公司），胰酶（索萊寶公司），DNase I（索萊寶公司），纖維連接蛋白（Pro Specbio公司），細(xì)胞角蛋白19抗體（Epitomics公司），熒光二抗（KPL公司），噻唑藍(lán)（MTT，索萊寶公司）。

1.2 方法

1.2.1 HGBECs的分離、純化與培養(yǎng) 取下患者膽囊，避開(kāi)息肉部位切取約2cm×2cm膽囊組織，生理鹽水沖洗3遍。用預(yù)冷的含1%雙抗的PBS沖洗3遍。將組織轉(zhuǎn)移至盛有預(yù)冷DMEM／F12培養(yǎng)基的60mm培養(yǎng)皿中，剝?nèi)∩掀?。將上皮轉(zhuǎn)移至35mm培養(yǎng)皿（1號(hào)）中，加入預(yù)溫的Ⅳ型膠原酶（含20 μ／mL DNase I）2mL將整個(gè)上皮組織浸泡，37℃消化30min，每10min振蕩1次。將組織轉(zhuǎn)移至35mm培養(yǎng)皿（2號(hào)）中，用手術(shù)刀片反復(fù)刮取上皮，用DMEM／F12培養(yǎng)基沖洗組織后，再將組織放回1號(hào)培養(yǎng)皿中繼續(xù)消化30min，如此反復(fù)3次。將2號(hào)培養(yǎng)皿中的液體用吸頭吹打10多次后，200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。800r／min離心5min，棄上清液，沉淀重懸于DMEM／Fl2培養(yǎng)基中，再次800r／min離心5min，棄上清液，沉淀重懸于含20%FBS的DMEM／Fl2培養(yǎng)基中，接種到60mm的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)1h。輕輕吸取培養(yǎng)基，800r／min離心5min，棄上清液，沉淀分別重懸于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全培養(yǎng)基中。臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至（1～3）×106／mL接種于12孔培養(yǎng)板中用纖維連接蛋白包被好的細(xì)胞爬片上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，以后每2～3d換液1次。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及其生長(zhǎng)的基本情況。

1.2.2 培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光化學(xué)鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)6d后，吸棄培養(yǎng)液；PBS漂洗3次，每次5min；4%多聚甲醛固定15 min；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；3%胎牛血清清蛋白封閉1h；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；滴加1∶250稀釋的一抗（兔抗人多克隆抗體），4℃過(guò)夜；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；滴加1∶1 000稀釋的熒光二抗（羊抗兔），避光孵育30min；避光PBS漂洗3次，每次5min；含0.5μg／mL DAPI的封片液封片。陰性對(duì)照組用含0.03%Triton的PBS代替一抗。

1.2.3 細(xì)胞分組、測(cè)量存活時(shí)間和細(xì)胞計(jì)數(shù) （1）細(xì)胞分組：根據(jù)添加生長(zhǎng)因子的不同，將細(xì)胞分為未添加細(xì)胞因子組、添加EGF組、添加EGF＋HGF組。（2）測(cè)量細(xì)胞存活時(shí)間：以細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)空泡當(dāng)天為存活的最后1d，測(cè)量每組12孔細(xì)胞的存活時(shí)間。（3）細(xì)胞計(jì)數(shù)：分別于培養(yǎng)第3～10天從每組中隨機(jī)抽取3孔，每孔在20倍鏡下采集3個(gè)視野；計(jì)數(shù)每個(gè)視野中上皮細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于纖維連接蛋白包被的96孔培養(yǎng)板中，分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第3～10天后加入MTT溶液20μL，37℃培養(yǎng)箱中維持4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min后，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定OD值。每組設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的孔為空白對(duì)照孔。以時(shí)間為橫軸，吸光度值均值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性 原代培養(yǎng)的膽囊上皮細(xì)胞接種1 d可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，3組細(xì)胞在3d時(shí)形態(tài)相似，即成大小不等的“細(xì)胞島”（圖1A）。未添加細(xì)胞因子組細(xì)胞形態(tài)呈錐形，生長(zhǎng)緩慢，6d左右細(xì)胞間連接松散（圖1B），至9d左右細(xì)胞出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡，細(xì)胞變大逐漸死亡（圖1C），平均存活時(shí)間為（10.3±2.2）d。添加EGF組細(xì)胞形態(tài)在6d時(shí)形成多邊形或者錐形并形成較大的“細(xì)胞島”（圖1D），生長(zhǎng)較未添加細(xì)胞因子組快，細(xì)胞數(shù)量增多，9d左右“細(xì)胞島”逐漸擴(kuò)大（圖1E），細(xì)胞間連接也比未添加細(xì)胞因子組緊密，12d左右細(xì)胞間連接開(kāi)始松散，細(xì)胞形態(tài)接近多邊形（圖1F），平均存活時(shí)間為（14.2±2.4）d。與未添加細(xì)胞因子組相比，存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。EGF＋HGF組細(xì)胞形態(tài)在6d左右近似多邊形，細(xì)胞排列緊密，呈典型的“鋪路石”狀生長(zhǎng)（圖1G、H），細(xì)胞增殖快，立體感強(qiáng)，細(xì)胞密度加大，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，9d時(shí)細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)（圖1I），18d左右細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始由多邊形變成梭形，細(xì)胞間隙加大（圖1J），21d左右細(xì)胞出現(xiàn)空泡并逐漸死亡，平均存活時(shí)間為（19.3±2.5）d。與添加EGF組比較，存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），EGF聯(lián)合HGF培養(yǎng)更能長(zhǎng)時(shí)間維持膽囊上皮細(xì)胞的形態(tài)。

圖1 各組細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)情況

2.2 細(xì)胞鑒定 細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin－19，CK－19）是膽管上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均不表達(dá)，可用于鑒定膽管上皮細(xì)胞。熒光染色后可見(jiàn)細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞間緊密連接，細(xì)胞核呈橢圓形位于細(xì)胞質(zhì)中央（圖2）。

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，培養(yǎng)3d和4d時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)3組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)5～10d，添加HGF＋EGF組細(xì)胞數(shù)量明顯多于添加EGF組，添加EGF組明顯多于未添加細(xì)胞因子組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。未添加細(xì)胞因子組細(xì)胞在培養(yǎng)第5～8天生長(zhǎng)活躍，第9天后生長(zhǎng)減慢；添加EGF組細(xì)胞第5～8天增殖快，第9天后進(jìn)入平臺(tái)期，衰減趨勢(shì)低于未添加細(xì)胞因子組；添加HGF＋EGF組細(xì)胞至第10天增殖仍然迅速，生長(zhǎng)旺盛，與未添加細(xì)胞因子組和添加EGF組比較具有較好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)圖3。

圖2 人膽囊上皮細(xì)胞CK－19鑒定（×630）

2.4 MTT檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，培養(yǎng)3d和4d時(shí)，3組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)5d時(shí)，與未添加細(xì)胞因子組比較，添加EGF組細(xì)胞活力沒(méi)有明顯增強(qiáng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與添加EGF組細(xì)胞比較，添加HGF＋EGF組細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)6～10d，添加HGF＋EGF組細(xì)胞活力顯著高于其他兩組，其活力在培養(yǎng)8d時(shí)下降，但幅度緩慢，添加EGF組細(xì)胞活力優(yōu)于未添加細(xì)胞因子組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。未添加細(xì)胞因子組細(xì)胞在培養(yǎng)第4～6天活力上升，第9天后迅速衰減；添加EGF組細(xì)胞第4～7天增殖快，之后進(jìn)入平臺(tái)期，第9天后逐漸減低，衰減趨勢(shì)低于未添加細(xì)胞因子組；添加HGF＋EGF組細(xì)胞在第9天活力最強(qiáng)，之后逐漸衰減，與未添加細(xì)胞因子組和添加EGF組比較，能較長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞活力（圖4）。

圖3 3組細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

表1 各組人膽囊上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)比較s，n＝3）

表1 各組人膽囊上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)比較s，n＝3）

＊：P＜0.05，與未添加細(xì)胞因子組比較；▲：P＜0.05，與添加EGF組比較；＃：P＜0.001，3組間兩兩比較；◆：P＜0.001，與未添加細(xì)胞因子組和添加EGF組分別比較。

培養(yǎng)時(shí)間組別3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d未添加細(xì)胞因子組 5.6±2.1 9.7±3.2 16.0±3.0 30.3±1.5＃ 49.3±3.1 69.7±4.9 71.3±8.1 46.0±4.4＃添加EGF組 6.3±3.1 10.7±4.5 26.0±3.7＊ 53.3±4.7＃ 87.3±3.1＊ 108.7±5.5＊ 125.0±11.0＊ 131.0±17.1＃添加EGF＋HGF組 5.0±1.2 11.0±4.6 35.3±2.1＊▲ 76.3±4.0＃ 129.3±12.0◆ 171.7±12.1◆ 213.0±10.1◆ 248.0±4.6＃

表2 MTT檢測(cè)各組人膽囊上皮細(xì)胞活力±s，n＝3）

表2 MTT檢測(cè)各組人膽囊上皮細(xì)胞活力±s，n＝3）

＊：P＜0.05，與未添加細(xì)胞因子組比較；▲：P＜0.05，與添加EGF組比較；＃：P＜0.001，與未添加細(xì)胞因子組比較。

培養(yǎng)時(shí)間組別3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d未添加細(xì)胞因子組 0.254±0.093 0.297±0.084 0.423±0.075 0.513±0.113 0.522±0.054 0.504±0.087 0.453±0.087 0.285±0.121添加EGF組 0.247±0.132 0.287±0.077 0.442±0.088 0.574±0.045＊ 0.633±0.057＊ 0.626±0.056＊ 0.586±0.097＊ 0.493±0.110＊＃添加EGF＋HGF組 0.256±0.110 0.307±0.067 0.538±0.079▲ 0.726±0.077▲＃0.744±0.048▲＃0.716±0.046▲＃0.697±0.076▲＃0.643±0.098▲＃

圖4 3組細(xì)胞MTT檢測(cè)情況

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在Joplin等［1－4］研究的基礎(chǔ)上改良了膽囊上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，成功培養(yǎng)膽囊上皮細(xì)胞，并能穩(wěn)定維持19d左右。在培養(yǎng)方法上有較多創(chuàng)新，如本實(shí)驗(yàn)首次采用首先剝離上皮的方法，可以最大幅度減少其他細(xì)胞，尤其是纖維細(xì)胞的污染，得到的細(xì)胞純度較高；由于膽管上皮細(xì)胞僅占肝細(xì)胞總數(shù)的3%～5%，采用反復(fù)酶消化和刮取上皮組織，這樣可以收集到較多上皮細(xì)胞；加入EGF和HGF，同時(shí)把胎牛血清濃度提高到20%，以滿足膽囊上皮細(xì)胞特殊的生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)方法的建立能夠有效地為肝膽疾病的研究提供技術(shù)支撐。

CK屬于中間纖維蛋白家族，是細(xì)胞骨架的構(gòu)成部分，CK－19只在膽管腫瘤細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及其祖細(xì)胞中表達(dá)，在肝細(xì)胞、肝干細(xì)胞及肝腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)，因此CK－19是目前公認(rèn)的膽管上皮細(xì)胞的特征性標(biāo)記物［5］。

EGF是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的添加劑，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道［6－8］在肝內(nèi)外膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)中絕大多數(shù)都使用了EGF，因其能夠促進(jìn)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的增殖［9－10］。

HGF是成熟肝細(xì)胞DNA合成最強(qiáng)的刺激因子和肝損傷后再生的激發(fā)因子，是肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的一種有效促分裂劑［11］。HGF廣泛分布于肝臟各種細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞中。HGF具有許多生物學(xué)功能，但對(duì)肝細(xì)胞的作用最為顯著，表現(xiàn)在HGF可以抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，恢復(fù)肝細(xì)胞功能。HGF可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)從而抑制了肝［12］、腎［13］、肺［14］等器官的纖維化過(guò)程。目前知道 HGF能促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞增殖，但HGF與膽囊、膽管關(guān)系的研究并不多見(jiàn)。有學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用HGF和EGF成功地分別將胚胎干細(xì)胞［15］和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［16］誘導(dǎo)向膽管上皮樣細(xì)胞分化，HGF聯(lián)合EGF能誘導(dǎo)干細(xì)胞向膽管上皮樣細(xì)胞分化，說(shuō)明在膽管上皮細(xì)胞的發(fā)生、生長(zhǎng)、存活乃至結(jié)構(gòu)和功能上，HGF和EGF發(fā)揮著協(xié)同促進(jìn)的作用。因此，筆者聯(lián)合應(yīng)用HGF和EGF培養(yǎng)人膽囊上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組細(xì)胞存活時(shí)間（19.3±2.5）d比只用EGF培養(yǎng)的細(xì)胞存活時(shí)間（14.2±2.4）d長(zhǎng)5d左右，細(xì)胞活力強(qiáng)，能較長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞間的緊密連接和典型的“鋪路石”狀態(tài)，盡管HGF＋EGF組細(xì)胞活力在8d時(shí)下降，但幅度比EGF組和無(wú)細(xì)胞因子組緩慢，而且HGF＋EGF組細(xì)胞在8d以后仍然持續(xù)增殖，說(shuō)明HGF對(duì)膽囊上皮細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。筆者通過(guò)創(chuàng)新和改良了人膽囊上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，顯著促進(jìn)其增殖，延長(zhǎng)其體外存活時(shí)間和形態(tài)特征。這種新方法的建立將為未來(lái)肝膽細(xì)胞的研究提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

［1］Joplin R，Kachilele S.Human intrahepatic biliary epithelial cell lineages：studies in vitro［J］.Methods Mol Biol，2009，481：193－206.

［2］Hashimoto W，Sudo R，F(xiàn)ukasawa K，et al.Ductular network formation by rat biliary epithelial cells in the dynamical culture with collagen gel and dimethylsulfoxide stimulation［J］.Am J Pathol，2008，173（2）：494－506.

［3］Nagaya M，Katsuta H，Kaneto H，et al.Adult mouse intrahepatic biliary epithelial cells induced in vitro to become insulin－producing cells［J］.J Endocrinol，2009，201（1）：37－47.

［4］Ishida Y，Smith S，Wallace L，et al.Ductular morphogenesis and functional polarization of normal human biliary epithelial cells in three－dimensional culture［J］.J Hepatology，2001，35（1）：2－9.

［5］Ochiai K，Yamamoto S，Ando H.Isolation and culture of biliary epithelial cells from bile duct remnants of patients with biliary atresia［J］.Pediatr Surg Int，2004，20（9）：685－688.

［6］柴成偉，鄭帥玉，魏明發(fā)，等.表皮生長(zhǎng)因子對(duì)小鼠肝外膽管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（20）：3057－3060.

［7］Komori A，Nakamura M，F(xiàn)ujiwara S，et al.Human intrahepatic biliary epithelial cell as a possible modulator of hepatic regeneration：Potential role of biliary epithelial cell for hepatic remodeling in vivo［J］.Hepatol Res，2007，37（3）：438－443.

［8］Katayanagi K，Kono N，Nakanuma Y.Isolation，culture and characterization of biliary epithelial cells from different anatomical levels of the intrahepatic and extrahepatic biliary tree from a mouse［J］.Liver，1998，18（2）：90－98.

［9］Efimova EA，Glanemann M，Liu L，et al.Effects of human hepatocyte growth factor on the proliferation of human hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Eur Surg Res，2004，36（5）：300－307.

［10］Joplin R，Hishida T，Tsubouchi H，et al.Human intrahepatic biliary epithelial cells proliferate in vitro in response to human hepatocyte growth factor［J］.J Clin Invest，1992，90（4）：1284－1289.

［11］呂璟.肝再生相關(guān)細(xì)胞因子的探究［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2005，11（2）：174－179.

［12］Xia JL，Dai C，Michalopoulos GK，et al.Hepatocyte growth factor attenuates liver fibrosis induced by bile duct ligation［J］.Am J Pathol，2006，168（5）：1500－1512.

［13］Schievenbusch S，Strack I，Scheffler M，et al.Combined paracrine and endocrine AAV9mediated expression of hepatocyte growth factor for the treatment of renal fibrosis［J］.Mol Ther，2010，18（7）：1302－1309.

［14］Long X，Xiong SD，Xiong WN，et al.Effect of intramuscular injection of hepatocyte growth factor plasmid DNA with electroporation on bleomycin－induced lung fibrosis in rats［J］.Chin Med J（Engl），2007，120（16）：1432－1427.

［15］Hu AB，He XS，Cai JY，et al.Biliary epithelial cell differentiation from embryonic stem cells in vitro［J］.J Clin Rehabilita Tis Engin Res，2008，12（9）：5783－5787.

［16］Zhang C，Yang YL，Lin MJ，et al.In vitro induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bile duct epithelial－like cells［J］.Chin J Tis Engin Res，2013，17（1）：17－22.