硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸和乳酸濃度的影響

張 軍 王夢(mèng)芝 郝志敏 喻禮懷 王洪榮*

(1.揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)，揚(yáng)州 225009;3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

目前，伴隨著反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高，反芻動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中精料補(bǔ)充飼料的比例也在不斷加大。而眾所周知的是，飼糧中精料比例的增加有可能導(dǎo)致瘤胃快速降解碳水化合物的爆發(fā)式降解，進(jìn)而導(dǎo)致酸中毒等營養(yǎng)代謝病的發(fā)生，而最終將影響動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能［1］。硫胺素(又稱為維生素B1)屬水溶性維生素，是動(dòng)物體內(nèi)能量代謝途徑中重要的輔酶。它以硫胺素焦磷酸輔酶(TPP)的形式參與碳水化合物代謝過程中α-酮酸的氧化脫羧反應(yīng)，是動(dòng)物體內(nèi)整個(gè)能量代謝過程和支鏈氨基酸代謝所必需的水溶性維生素［2］。高精料飼糧快速降解碳水化合物含量高，則其代謝中硫胺素的需求也高，這則可能會(huì)導(dǎo)致硫胺素的缺乏。而硫胺素缺乏可能導(dǎo)致中間代謝受阻，進(jìn)而可能引發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)，飼料和能量利用效率降低。近年來，關(guān)于硫胺素用于反芻動(dòng)物SARA防治方面已有相關(guān)的研究報(bào)道［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究也已表明，奶牛在精粗比為3∶7條件下可以不添加硫胺素，而在6∶4 條件下則需要添加硫胺素［4］，但迄今其具體的添加量還沒有明確論斷，為此，本試驗(yàn)在高精料條件下添加硫胺素，測(cè)定其培養(yǎng)液中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)以及乳酸濃度的變化情況，以初步篩選高精料條件下硫胺素合適的添加量，為下一步體內(nèi)試驗(yàn)添加量的確定提供一些參考，同時(shí)也為集約化飼養(yǎng)條件下反芻動(dòng)物SARA的防治提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

由揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司第一牧場(chǎng)選擇4頭身體健康狀況良好，體重相近，安裝瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)用牛在試驗(yàn)期間飼喂該牧場(chǎng)常用全混合日糧(TMR)，每日07:00和19:00分2次等量飼喂，自由飲水，用于采集瘤胃液。

1.2 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用鹽酸硫胺素的純度≥99%，購自天津福德士科技有限公司。

試驗(yàn)選用單因子5水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，A為對(duì)照組，不添加硫胺素，B、C、D、E組為試驗(yàn)組，分別添加60、120、180和240 mg/kg的鹽酸硫胺素(各試驗(yàn)組硫胺素的有效添加量分別為53.50、107.00、160.50、214.00 mg/kg)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。底物組成與硫胺素添加量見表1。由于底物采用半純合飼糧配制，由表1中可知，底物精粗比［(小麥淀粉+可溶性淀粉+酪蛋白)∶(木聚糖+果膠+羧甲基纖維素+濾紙纖維素)］為6∶4，粗蛋白質(zhì)含量為17%。由于硫胺素的添加量很少，在培養(yǎng)前先將鹽酸硫胺素溶解在水中，然后按設(shè)計(jì)的劑量換算后添加至培養(yǎng)液中。

參照 De Oliveira等［5］的方法配制精粗比 6∶4條件下的人工唾液鹽，組成見表2。人工唾液鹽在使用前1天配制，并通入二氧化碳(CO2)待用。

表1 底物組成與硫胺素的添加量Table 1 Substrate composition and thiamine supplemental level

表2 人工唾液鹽組成Table 2 Composition of artificial saliva g/L

1.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

在奶牛晨飼前，利用自制真空負(fù)壓裝置，4頭瘺管牛分別各采集瘤胃液150 mL，經(jīng)紗布過濾后裝入保溫瓶，并通CO2，置于恒溫水浴中保溫。

于采樣前3小時(shí)配制好人工唾液鹽，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱取底物原料，各加入之前配制好的人工唾液鹽80 mL，再各加入采集后經(jīng)過濾的瘤胃液40 mL，通過進(jìn)氣通道通入CO2氣體至飽和，并放置于恒溫水浴箱中。另外增設(shè)1個(gè)瘤胃液與人工唾液鹽混合無底物的空白對(duì)照。

于培養(yǎng)后 0、1、3、6、10、24、48、72 h 取培養(yǎng)液樣，每次取5 mL，于-20℃冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸和乳酸濃度的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 揮發(fā)性脂肪酸

培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸濃度使用日本島津GC-9A氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定［6］。

1.4.2 乳酸

培養(yǎng)液乳酸濃度的測(cè)定采用對(duì)羥基聯(lián)苯法［7］進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理;用SPSS 17.0的one way-ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵乳酸濃度的影響

由表3可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各試驗(yàn)組乳酸的濃度整體上呈先上升后下降，再上升而后下降，并趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。而隨著硫胺素添加量的增加，各試驗(yàn)組乳酸濃度基本呈降低的趨勢(shì)，但在最高添加量的E組略有升高。

從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，0 h時(shí)，乳酸濃度在組間沒有顯著的差異(P＞0.05);1、3 h時(shí)，D組乳酸濃度顯著低于B和C組(P＜0.05)，極顯著低于A組和E組(P＜0.01);6、10 h時(shí)，D組顯著低于C和E組(P＜0.05)，極顯著低于A和B組(P＜0.01);24 h時(shí)，D組顯著低于A和B組(P＜0.05)，與C和E組差異不顯著(P＞0.05);48、72 h時(shí)，各試驗(yàn)組的乳酸濃度均與對(duì)照組乳酸濃度差異不顯著(P＞0.05)。

表3 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵乳酸濃度的影響Table 3 Effects of thiamine on lactate concentration of high concentrate substrate after in vitro rumen fermentation mmol/L

2.2 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響

由表4可見，總體上，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組乙酸、丙酸、丁酸的濃度皆呈逐漸上升的趨勢(shì);但在72 h時(shí)略有下降。

從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，6 h時(shí)，D、E組乙酸濃度顯著或極顯著低于A組(P＜0.05或P＜0.01)，而B、C組與A組差異不顯著(P＞0.05);其他時(shí)間點(diǎn)各試驗(yàn)組和A組相比差異都不顯著(P＞0.05)。6 h時(shí)，C、E組丙酸濃度顯著低于A、B、D組(P＜0.05);48 h時(shí)，D、E組均顯著高于A、B組(P＜0.05)。丁酸濃度除6 h時(shí)B、C組顯著或極顯著低于其他各組(P＜0.05或P＜0.01)外，其他各時(shí)間點(diǎn)各組之間差異均不顯著(P＞0.05)。

由表5可見，培養(yǎng)液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸上升，并在72 h時(shí)略有下降。其中以D組最高，為41.74 mmol/L。

從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)開始0 h時(shí)，TVFA濃度組間的差異不顯著(P＞0.05);1 h時(shí)，E組顯著高于其他各組(P＜0.05);3 h時(shí)，B組顯著高于C、D、E組(P＜0.05);10 h時(shí)，B組顯著高于A和C組(P＜0.05);24、48、72 h時(shí)，雖然組間的差異不顯著(P＞0.05)，但數(shù)值上皆以 D組最高。

表4 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響Table 4 Effects of thiamine on volatile fatty acid concentrations of high concentrate substrate after in vitro rumen fermentation mmol/L

培養(yǎng)液中乙酸與丙酸比例隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)波動(dòng)變化。其中D組在相對(duì)較低的水平波動(dòng)，其平均值為1.55。

從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)開始0 h時(shí)，乙酸與丙酸比例在組間的差異不顯著(P＞0.05);1 h時(shí)，A組顯著高于 C、D、E組(P＜0.05);6 h時(shí)，C組顯著高于其他各組(P＜0.05);24、48、72 h時(shí)，D組皆顯著或極顯著低于A組(P＜0.05或 P＜0.01)。

3 討論

3.1 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵乳酸濃度的影響

長期以來，人們一直認(rèn)為反芻動(dòng)物瘤胃的微生物能合成充足的硫胺素，并能滿足其營養(yǎng)代謝的需要［8-10］。然而，在集約化的生產(chǎn)中，反芻動(dòng)物在高精料的飼養(yǎng)條件或泌乳期及妊娠期等特殊生理狀況下，也需要在飼糧中添加硫胺素等水溶性維生素。硫胺素以TPP的形式參與碳水化合物代謝過程中α-酮酸的氧化脫羧反應(yīng)，一旦機(jī)體缺乏硫胺素，則碳水化合物代謝受阻，就會(huì)導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物乳酸積累及揮發(fā)性脂肪酸比例的失衡而誘發(fā)瘤胃酸中毒或SARA。有研究報(bào)道，奶牛的飼糧從粗飼料突然轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔锨闆r下，瘤胃中微生物群體改變，瘤胃球菌消失，而乳酸利用菌成為了瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)乳酸的濃度增加［11］。韓昊奇等［12］對(duì)奶山羊的研究也表明，非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(NFC/NDF)升高至1.63時(shí)，瘤胃乳酸桿菌及壞死梭形桿菌的數(shù)量顯著增加。

表5 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵總揮發(fā)性脂肪酸濃度和乙酸與丙酸比例的影響Table 5 Effects of thiamin on total volatile fatty acid concentration and acetate/propionate of high concentrate substrate after in vitro rumen fermentation

本試驗(yàn)中，在高精料底物培養(yǎng)條件下添加硫胺素，結(jié)果培養(yǎng)液中乳酸的濃度呈降低的趨勢(shì)，并以D組添加180 mg/kg的硫胺素效果最好。其原因可能是:添加硫胺素促進(jìn)了瘤胃微生物對(duì)乳酸的吸收利用(在體內(nèi)還有瘤胃上皮細(xì)胞的吸收)，或者是促進(jìn)了乳酸的轉(zhuǎn)化而使其積累量減少;也可能是改變了微生物的群體結(jié)構(gòu)而使乳酸的產(chǎn)生量減少。乳酸濃度的降低可緩解酸中毒的發(fā)生而提高生產(chǎn)性能，這與前人研究發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)奶牛飼喂的高精料飼糧中添加硫胺素有助于提高生產(chǎn)性能［3］是一致的。但至于其乳酸濃度降低，具體的機(jī)理，如微生物區(qū)系的變化、乳酸的代謝去路等一系列問題還有待于進(jìn)一步的研究。

3.2 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸主要來源于飼糧中碳水化合物的發(fā)酵，其濃度和比例主要受飼糧組成的影響。飼糧中的碳水化合物在動(dòng)物采食后在瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，同時(shí)，隨著瘤胃微生物的生長繁殖部分揮發(fā)性脂肪酸被利用，加之瘤胃上皮細(xì)胞吸收揮發(fā)性脂肪酸，以及揮發(fā)性脂肪酸隨食糜向后消化道排出，揮發(fā)性脂肪酸濃度呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。本研究TVFA濃度在培養(yǎng)后逐漸增加，其原因可能是:體外試驗(yàn)與體內(nèi)試驗(yàn)不同，產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸不能夠被瘤胃上皮細(xì)胞吸收和隨食糜排出。但體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液具有一定的緩沖能力，TVFA在一定的范圍內(nèi)并不會(huì)影響微生物的正常發(fā)酵［13］;同時(shí)，這也能在一定程度上反映微生物的發(fā)酵力。本試驗(yàn)表明，以D組添加180 mg/kg水平硫胺素的TVFA濃度最高，這提示該添加量可改善發(fā)酵環(huán)境和提高微生物的發(fā)酵力。

揮發(fā)性脂肪酸可以為反芻動(dòng)物提供70%～80%的消化能［14-15］，并且通過揮發(fā)性脂肪酸代謝還可為瘤胃消化代謝提供大部分能量［16］。其中乙酸和丙酸均能在反芻動(dòng)物代謝過程中提供能量，且丙酸發(fā)酵產(chǎn)生的能量較多，乙酸與丙酸比例過高會(huì)影響能量的利用效率［17］，而不利于高精料催肥。由本試驗(yàn)結(jié)果可看出，乙酸與丙酸比例在培養(yǎng)開始的0～1 h在2.05～2.87變動(dòng)，這表明發(fā)酵偏向于乙酸型;而在培養(yǎng)3 h后則下降至1.61～1.75，這表明發(fā)酵偏向于丙酸型。以上可能是由于發(fā)酵之初，瘤胃微生物的發(fā)酵更接近于所采集奶牛瘤胃中的體內(nèi)發(fā)酵，而在高精料的培養(yǎng)底物開始發(fā)酵后，丙酸則迅速增加而導(dǎo)致了乙酸與丙酸比例的下降。在培養(yǎng)3 h后，乙酸與丙酸比例雖然在組間(除10 h測(cè)定時(shí)間點(diǎn)外)有顯著差異，但都在1.16～1.87變動(dòng)，這表明高精料底物培養(yǎng)條件下以偏向于丙酸型發(fā)酵?？傮w上，還是以D組添加180 mg/kg的硫胺素乙酸與丙酸比例較低，結(jié)合其TVFA濃度最高，認(rèn)為補(bǔ)充硫胺素可以維持高精料底物培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定發(fā)酵。本試驗(yàn)可為目前反芻動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中，規(guī)?；?、集約化、高精料飼養(yǎng)方式下容易引發(fā)的瘤胃SARA的防治提供一種新的解決思路。

4 結(jié)論

①高精料條件下，添加硫胺素整體上降低了培養(yǎng)液乳酸的濃度，并以添加180 mg/kg硫胺素組效果較好，同時(shí)該組還提高了TVFA的濃度，降低了乙酸與丙酸比例。

②添加180 mg/kg的硫胺素能夠較好地穩(wěn)定高精料(6∶4)底物的瘤胃發(fā)酵。

［1］MUTSVANGWA T，WRIGHT，T C.Sub-acute ruminal acidosis(SARA)in dairy cows［M］.Ontario:Ministry of Agriculture and Food，2003.

［2］COMBS G F，Jr.The vitamins:fundamental aspects in nutrition and health［J］.American Journal of Clinical Nutrition，1991，53(3):755-763.

［3］SHAVER R D，BAL M A.Effect of dietary thiamin supplementation on milk production by dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2000，83(10):2335-2340.

［4］張紅偉.硫胺素(VB1)對(duì)瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響［D］.碩士學(xué)位論文.揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2010.

［5］DE OLIVEIRA L A，JEAN-BLAIN C，KOMISARCZUK-BONY S，et al.Microbial thiamin metabolism in the rumen simulating fermenter:the effect of acidogenic conditions，a high sulfur level and added thiamin［J］.British Journal of Nutrition，1997，78(4):599-613.

［6］熊本海，盧德勛，高俊.綿羊瘤胃VFA吸收效率及模型參數(shù)的研究［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1999，11(S1):248-255.

［7］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.2版.北京:高等教育出版社，1997:422-428.

［8］BECHDEL S I，HONEYWELL H E，DURCHER R A，et al.Synthesis of vitamin B in the rumen of the cow［J］.Journal of Biological Chemistry，1928，80(1):231-238.

［9］MILLER B L，MEISKE J C，GOODRICH R D.Effect of grain source and concentrate level on B-vitamin production and absorption in steers［J］.Journal of Animal Science，1986，62(2):473-483.

［10］ZINN R A，OWEN F N，STUART R L，et al.B-vitamin supplementation of diets for feedlot calves［J］.Journal of Animal Science，1987，65(1):267-277.

［11］TAJIMA K，ARAI S，OGATA K，et al.Rumen bacterial community transition during adaptation to highgrain diet［J］.Anaerobe，2000，6(5):273-284.

［12］韓昊奇，劉大程，高民，等.不同NFC/NDF比對(duì)奶山羊瘤胃微生物及瘤胃pH值變化的影響［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，25(4):597-603.

［13］PREVOT S，SENAUD J，BOHATIER J，et al.Variation in the composition of the ruminal bacterial microflora during the adaptation phase in an artificial fermentor(Rusitec)［J］.Zoological Science，1994，11:871-878.

［14］馮仰廉.反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［15］VAN HOUTERT M.Challenging the retinal for altering VFA ratios in growing ruminates［J］.Feed Mix，1996，4(1):8-12.

［16］BANNINK A，F(xiàn)RANCE J，LOPEZ S，et al.Modelling the implications of feeding strategy on rumen fermentation and functioning of the rumen wall［J］.Animal Feed Science and Technology，2008，143(1/2/3/4):3-26.

［17］?RSKOV E R，GRUBB D A，SMITH J S，et al.Efficiency of utilization of volatile fatty acids for maintenance and energy retention by sheep［J］.British Journal of Nutrition，1979，41(3):541-552.