不同表面形貌的純鈦種植體對牙齦軟組織界面影響的掃描電鏡觀察

李家奇，孟維艷，周延民，蔡 青，阿 蘭，付 麗，李保勝，王世振

（1.吉林大學口腔醫(yī)院種植中心，吉林 長春 130021；2.山東省德州市人民醫(yī)院口腔科，山東 德州 253000）

種植義齒已成為全口或部分牙齒缺失修復的主要手段，并且有較高的成功率[1]。種植義齒的成功與否不僅取決于良好的骨結合，軟組織封閉對于種植修復的長期成功率來說也是極其重要的[2]。軟組織可形成種植體周圍的生物學封閉，從而保護下面的骨組織免受微生物的侵襲。一些體外和動物實驗研究[3]已證實：種植體表面的微形貌是影響成纖維細胞黏附和分化的關鍵因素。相對于光滑表面，不同的表面處理方法得到的的粗糙表面可改變上皮細胞和成纖維細胞的形態(tài)、增殖和基因表達[4]，對于提高軟組織的整合有顯著優(yōu)勢，可阻止牙齦根方遷移和細菌的入侵，從而提高軟組織穩(wěn)定性和封閉作用，減少骨吸收[5]。研究[6－7]還發(fā)現(xiàn)：與光滑表面相比，具有微米－納米表面的種植體可誘導成纖維細胞黏附和改變膠原纖維方向，促進牙齦組織的黏附，并且納米表面可以調(diào)節(jié)成纖維細胞的炎癥反應。本研究旨在通過比較光滑表面與微米－納米表面對軟組織的影響，尋找出一種可促進牙齦軟組織附著的純鈦表面形貌，并為今后種植體頸部設計提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗試件的制備

圓柱形純鈦試件（D 3mm×11mm，萊頓北京生物材料制品公司提供）40個，使用砂紙（耐水砂紙600目、耐水砂紙320目、不耐水砂紙320目、不耐水砂紙160目）依次對鈦柱表面進行打磨，再使用不同溶液（丙酮、無水乙醇和蒸餾水）對鈦件依次沖洗10min。試件隨機分成4組，每組10個。光滑組（S組）：不做任何處理；酸蝕組（AE組）：用一定濃度（1∶199）氫氟酸對鈦柱軸面進行2min酸蝕處理；電化學腐蝕組（ECE組）：用自制電解儀對鈦柱軸面進行直流電化學處理，采用不同濃度（0.1～17.0mol·L－1）氫氟酸得到2種不同表面，分別為ECE1和ECE2組；電化學腐蝕加酸蝕組（ECA組）：在ECE2組處理的基礎上再用一定濃度（1∶199）氫氟酸對鈦柱軸面進行2min酸蝕處理。處理過的種植體再經(jīng)上述3種溶液依次超聲清洗10min，高溫（121.3℃）、高壓（1.05kg·cm－2）20min滅菌后備用。

1.2 實驗動物

健康成年雜種犬（吉林大學和平小區(qū)動物醫(yī)院實驗中心提供）6只，雌、雄各半，體質(zhì)量12～14kg。

1.3 方 法

犬以速眠新注射液（吉林大學和平校區(qū)動物醫(yī)院提供）肌肉注射（0.1mL·kg－1），麻醉成功后，口腔消毒，口外鋪巾，局部黏骨膜下注射2%利多卡因。采用微創(chuàng)拔牙器械拔除犬右側下頜第一和第二前磨牙、左側第一前磨牙。甲硝唑和生理鹽水反復沖洗拔牙創(chuàng)，采用即刻種植＋非埋植種植術，用組合鉆（鉆速＜1 500r·min－1）逐級備孔，按預定順序植入5枚種植體（即S組、AE組、ECE1組、ECE2組和ECA組各1顆），頂端高于黏膜3mm，扭力達到30N。種植體均無咬合接觸，緊密縫合牙齦。術后每天肌注青霉素80萬U，連用5d。每天用1%洗必泰液擦洗口腔1次，連擦7d。各組犬均予軟飼料喂養(yǎng)?？p合線任由脫落。種植術后20d時處死3只，3個月時處死3只。

1.4 掃描電鏡標本制備

用鋸條取下含種植體的下頜骨塊，用片鋸修建成1cm×1cm×1cm骨、牙齦和種植體聯(lián)合標本，以0.1mol·L－1磷酸緩沖液沖洗，固定于3%戊二醛2d。用Leica SP1600鋸式切片機從種植體中心位置沿縱軸切割，取一半標本以0.1mol·L－1磷酸緩沖液沖洗15min，0.5%鋨酸固定1h，再以0.1mol·L－1磷酸緩沖液15min，50%、70%、80%、90%和95%酒精逐級脫水各15min。真空干燥法干燥，噴金，掃描電鏡（SEM）觀察牙齦與種植體結合界面，然后再機械拉除軟組織，觀察種植體表面和軟組織黏附于種植體的組織面。

2 結 果

2.1 種植體表面掃描電鏡觀察

S組低倍鏡下（×180）觀察種植體表面較光滑（圖1A）；高倍鏡下（×20 000）見較淺的溝紋（圖1B）。AE組低倍鏡下（×500）觀察種植體表面微粗糙（圖1C）；高倍鏡下（×50 000）可見均勻密集的納米突，為20～100nm的圓鈍突起（圖1D）。ECE1組低倍鏡下（×40）見種植體表面粗糙，并可見均勻的凹孔（圖1E）；高倍鏡下（×500）見直徑約30～80μm圓形或橢圓形淺碟狀凹（圖1F），10 000倍鏡下見凹的表面呈蜂窩狀，邊緣不規(guī)則（圖1G）。ECE2組低倍鏡下（×200）見均勻細膩的微粗糙種植體表面（圖1H）；高倍鏡下（×500）見分布均勻的微米凹，該微米凹為圓形或橢圓形淺碟狀凹，凹內(nèi)含有散在的小孔（圖1I）；2 000倍鏡下可見微米凹的直徑約10～25μm（圖1J）。ECA組低倍鏡下（×50）可見種植體表面均勻細膩，微粗糙形態(tài)（圖1K）；200倍鏡下見分布均勻的微米－納米表面，該表面的微米凹為圓形或橢圓形淺碟狀凹，直徑約10～25μm，邊緣圓鈍，表面可見白色粒狀物質(zhì)形成，即納米突（圖1L）；該納米突在40 000倍鏡下可見均勻分布于微米凹的表面，呈直徑約20～80nm的半球形突起（圖1M）。

圖1 各組種植體表面掃描電鏡圖Fig.1 SEM pictures of implant surface in various groups

2.2 種植體及種植體周圍軟組織觀察

本組共有2只種植體松動，分別于術后3和5d時脫落。余下種植體周圍牙齦無紅腫，軟組織為粉紅色，較致密。種植體無松動，種植體周圍有少量軟垢。3個月時周圍牙齦粉紅致密，無紅腫，緊密包繞種植體周圍。種植體無松動，周圍有少量軟垢。

2.3 牙齦掃描電鏡觀察

2.3.1 種植體－上皮組織界面 掃描電鏡下觀察，各組犬牙齦上皮斷面呈層狀，表面角化層明顯，20d時結合上皮與種植體表面連接緊密，各組間比較未見明顯差異（圖2）；3個月時，上皮組織更加致密，上皮組織緊密附著在種植體表面，各組間未見明顯差異，但其厚度明顯大于生長20d時（圖3）。

2.3.2 種植體－結締組織界面 20d時，S組結締組織與種植體大部分開裂分離，膠原纖維伸向種植體表面時與種植體表面平行排列（圖4A）；AE組也可見結締組織與種植體部分開裂，膠原纖維呈樹枝狀，膠原纖維根部與種植體表面緊密垂直接觸（圖4B）；ECE1組結締組織開裂較少，膠原纖維比酸蝕組濃密，膠原纖維垂直緊密附著在種植體表面，呈簇狀（圖4C）；ECE2組結締組織開裂也較少，膠原纖維方向比較雜亂，呈網(wǎng)狀垂直扎向種植體表面（圖4D）；ECA組膠原纖維比較濃密，比AE組稍致密，呈綹狀垂直扎向種植體表面（圖4E）。3個月時，S組結締組織和種植體大部分開裂分離，膠原纖維致密排列，與種植體表面平行（圖4F）；AE組膠原纖維排列較濃密，膠原纖維垂直扎向種植體表面（圖4G）；ECE1組膠原纖維非常濃密，膠原纖維互相交錯垂直扎向種植體表面，可見部分不規(guī)律斜行纖維（圖4H）；ECE2組少量結締組織與種植體分離，膠原纖維緊密排列呈綹狀，垂直扎向種植體（圖4I）；ECA組膠原纖維比較濃密，膠原纖維互相交錯，垂直扎向種植體表面，可見不規(guī)律的斜行纖維（圖4J）。生長3個月的結締組織高度大于生長20d的結締組織。

圖2 20d時上皮組織與種植體表面結合部位掃描電鏡圖Fig.2 SEM pictures of conjunction of epithelium and implant surface at 20th day

圖3 3個月時上皮組織與種植體表面結合部位掃描電鏡圖Fig.3 SEM pictures of conjunction of epithelium and implant surface at 3rd month

圖4 20d和3個月時結締組織和種植體表面結合部位掃描電鏡圖Fig.4 SEM pictures of conjunction of collagen fibers and implant surface at 20th day and 3rd month

2.3.3 種植體表面 20d和3個月時掃描電鏡下 觀察種植體表面均未見明顯的上皮組織殘留物。20d時，S組種植體表面較干凈，見少量的膜狀物和極少量膠原纖維殘留，表面暴露大部分金屬紋理（圖5A和B）。AE組低倍鏡下見表面殘留膠原纖維量比光滑組多，呈斑片狀；高倍鏡下見膠原纖維與種植體表面垂直黏附（圖5C和D）。ECE1組低倍鏡下見種植體表面大部分被殘留的膠原纖維覆蓋；高倍鏡下見斷裂的膠原纖維垂直扎在種植體表面，部分膠原纖維平行于種植體（圖5E和F）。ECE2組低倍鏡下見種植體表面大部分被無定形基質(zhì)和膠原纖維覆蓋；高倍鏡下見部分無定形基質(zhì)與表面分離翹起，成簇的膠原纖維垂直扎向種植體表面（圖5G和H）。ECA組低倍鏡下見膠原纖維黏附于種植體表面呈簇狀；高倍鏡下見膠原纖維垂直黏附于種植體表面，部分無定形基質(zhì)與表面分離翹起（圖5I和J）。3個月時，S組低倍鏡下觀察種植體表面殘留少量膜狀物和膠原纖維，表面大部分暴露金屬紋理，高倍鏡下見殘留的膜狀物分離翹起，膠原纖維平行黏附在表面（圖6A和B）。AE組表面殘留的膜狀物和膠原纖維比S組多，低倍鏡下呈魚鱗狀，殘留的膠原纖維厚實；高倍鏡下發(fā)現(xiàn)膠原纖維垂直表面，其下面的無定形基質(zhì)大部分與種植體表面分離（圖6C和D）。ECE1組低倍鏡下見表面凹孔中殘留大量的膜狀物和膠原纖維；高倍鏡下見膠原纖維有水平平鋪于種植體表面，也可見有垂直伸向種植體表面（圖6E和F）。ECE2組低倍鏡下見表面殘留大量的膠原纖維，呈斑塊狀非常厚實；高倍鏡下見膠原纖維伸出2～3個突起扎在凹孔中（圖6G和H）。ECA組低倍鏡下見殘留大量的膠原纖維和膜狀物，呈龜裂的斑塊狀；高倍鏡下見膠原纖維垂直伸向種植體表面，像觸角一樣的突起緊緊抓在凹孔壁的納米突上（圖6I～K）。

圖5 20d時去除軟組織后種植體表面掃描電鏡圖Fig.5 SEM pictures of implant surface after removing soft tissue at 20th day

圖6 3個月時去除軟組織后種植體表面掃描電鏡圖Fig.6 SEM pictures of implant surface after removing soft tissue at 3rd month

2.3.4 與種植體表面黏附的軟組織界面 20d和3個月時與種植體表面黏附的牙齦組織面無顯著差別。S組與種植體黏附的牙齦組織面為光滑的一層無定形基質(zhì)膜狀結構（圖7A）。AE組與種植體黏附的牙齦組織面見與種植體表面納米突大小相對應的納米凹（圖7B）。ECE1組與種植體黏附的牙齦組織面見與種植體微米凹大小相對應且相對粗糙的微米突（圖7C）。ECE2組與種植體黏附的牙齦組織面見與種植體表面微米凹大小相對應的光滑突起，該突起頭大帶蒂鑲嵌在種植體表面（圖7D）。ECA組與種植體黏附的牙齦組織面見與種植體微米－納米結構大小相對應的微米突，該突起表面有大量納米凹，與種植體表面形成錯綜復雜的微米－納米鑲嵌結構（圖7E）。

圖7 牙齦軟組織與種植體結合部位的組織面掃描電鏡圖Fig.7 SEM pictures of tissue surfaces of gingival conjuncted with implant surface

3 討 論

種植修復是否成功與骨和軟組織對種植體表面的緊密附著有關，除了骨，軟組織黏附于種植體頸部的封閉作用也是非常重要的[8]。種植體通過不同表面改性方法得到的不同粗糙表面可對成纖維細胞和膠原纖維產(chǎn)生較大影響[9]。近年來，對粗化種植體頸部表面形貌，尤其是微米形貌和納米形貌的作用越來越受到關注[10]。

本組動物實驗中有2只種植體可能因進食或咬硬物等不確定因素導致脫落，其余種植體均與周圍組織結合良好。本研究觀察到：S組膠原纖維平行黏附于種植體表面，結締組織與種植體界面之間見較多大小不等的裂隙，撕脫軟組織后的種植體表面殘留的膠原纖維非常少，可見結締組織與光滑表面種植體的黏附力是較低的。本研究結果表明：改變種植體頸部的表面形貌是提高軟組織黏附的關鍵因素，尤其是多空三維的微米－納米形貌，可誘導成纖維細胞呈錨狀緊密扎在種植體表面空隙中，使結締組織緊密附著，改善軟組織黏附力[11]。本實驗通過電化學方法得到的具有微米凹的ECE2表面，膠原纖維垂直扎入微米凹中，開裂現(xiàn)象少見；結締組織與種植體結合的組織面形成頭大帶蒂的突起，該突起鑲嵌在種植體表面微米凹中，在撕脫軟組織這種強大的外力下，膠原纖維即使自身斷裂，而膠原纖維根方像觸手一樣緊緊抓在微米凹壁上，特別是結締組織生長3個月時的種植體表面，幾乎全部被殘留的膠原纖維覆蓋，足以看出這種微米表面與結締組織的黏附是很牢固的；ECA組結締組織未見與種植體表面開裂，結締組織組織面與種植體表面也形成了錯綜復雜的微米－納米鑲嵌結構，膠原纖維根方像觸手一樣垂直抓在微米凹和納米突上，有的一根膠原纖維甚至分出2～3個分支抓在納米突上，生長20d和3個月的種植體表面，均大部分被殘留的膠原纖維覆蓋，表明微米－納米表面與結締組織的黏附也非常緊密。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)：種植體表面大小適宜的空洞可以誘導結締組織膠原纖維垂直插入種植體表面，形成緊密結合，表明以上的微米表面和微米－納米表面均可促進結締組織緊密附著，ECA組兼具的納米表面更有優(yōu)勢。本研究中，AE組也可見結締組織與種植體表面開裂，垂直伸向種植體表面的膠原纖維只能抓在納米突上，結締組織組織面與種植體表面的納米級突起黏附，撕脫軟組織后的種植體表面殘留的膠原纖維不多，表明結締組織與種植體黏附力不及ECE2組和ECA組，但優(yōu)于S組；ECE1組種植體表面的微米凹為30～80μm，比ECE2組和ECA組的凹孔大，可見其表面有一部分膠原纖維平行黏附在種植體表面，而其他各實驗組均未見任何平行黏附的纖維。有研究[13]發(fā)現(xiàn)：膠原纖維平行排列的結締組織易向根方遷移，而垂直黏附的膠原纖維與種植體表面結合緊密，可防止其軟組織退縮。本研究中，ECE1組種植體表面殘留的膠原纖維較S組和AE組多，可推斷該表面結締組織的黏附力相對ECE2組和ECA組較弱，但優(yōu)于AE組和S組。以上實驗結果與Rossi等[14]研究結果相一致，與光滑種植體表面相比，粗糙多孔的微米－納米種植體表面確實與上皮組織和結締組織結合較緊密，軟組織不易脫離，炎癥反應輕且骨組織吸收少。本研究結果提示：種植體周圍牙齦上皮和結締組織的附著與種植體頸部的表面形貌密切相關，微米和微米－納米 表面可促進結締組織牢固附著，明顯改善牙齦組織與種植體頸部的黏附，從而阻止結合上皮的根方移動，防止細菌及產(chǎn)物進入骨組織內(nèi)，為種植的成功奠定基礎。目前種植體表面影響軟組織附著的微形貌大小形態(tài)研究結果不一，最適軟組織黏附的精準表面和具體機制還有待于進一步探討。

本研究雖發(fā)現(xiàn)上皮組織呈層狀黏附于種植體頸部，但將種植體與牙齦撕脫后，種植體表面未見任何殘留的上皮結構，可見上皮與種植體表面的黏附是非常脆弱的。本研究中，除S組外，結締組織膠原纖維均垂直呈網(wǎng)狀緊密黏附在種植體表面，撕脫牙齦后的種植體表面可見膠原纖維殘留，這與Nevins等[15]研究結果一致，說明牙齦組織主要是依靠結締組織黏附在種植體頸部，上皮組織的黏附作用非常微弱，結締組織是封閉口腔環(huán)境和種植體－骨組織界面的重要結構。本研究結果顯示：生長3個月時牙齦上皮和結締組織厚度均明顯大于生長20d的上皮和結締組織，可見軟組織生長成熟需要較長時間；同時發(fā)現(xiàn)：膠原纖維近種植體表面的一端埋在種植體表面的一層無定形物質(zhì)中，厚約20nm，將種植體表面與膠原纖維分隔開，特別是ECE2組和ECA組，撕脫掉軟組織后的種植體表面幾乎看不到金屬表面，只見與種植體表面形貌起伏相當?shù)臒o定形膜狀結構和殘留的膠原纖維，結締組織似乎是黏附在種植體表面，這種黏附可能有阻擋結合上皮根方遷移的作用。

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