系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療前后外周血NK細(xì)胞和受體表達(dá)變化及其治療作用機(jī)制

馮 莉，趙 令，馬 寧，姜振宇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累積多系統(tǒng)、多器官并由多種因素相互作用引起的自身免疫性結(jié)締組織病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，病程遷延反復(fù)，其病因及發(fā)病機(jī)制至今不明。大量研究[1]表明：多種因素通過(guò)影響細(xì)胞免疫功能紊亂而致病，SLE存在T、B細(xì)胞功能紊亂，但SLE患者外周血淋巴細(xì)胞亞群改變與疾病的活動(dòng)性之間的關(guān)系尚有爭(zhēng)論，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為T(mén)淋巴細(xì)胞功能的紊亂引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞的高度活化而產(chǎn)生多種自身抗體是本病發(fā)生和發(fā)展主要因素。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞具有多種功能，不僅是自然防御細(xì)胞，而且是體內(nèi)多種細(xì)胞，尤其是T、B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在機(jī)體正常的免疫、防御機(jī)制中起重要作用。目前，SLE

的治療主要是糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑，控制疾病過(guò)程中異常的炎癥和免疫反應(yīng)，對(duì)于治療前后

NK細(xì)胞及其受體表達(dá)的變化研究較少。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLE患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）治療前后外周血細(xì)胞NK細(xì)胞及其受體的表達(dá)變化，旨在探討其治療SLE的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月—2013年1月本院收治的26例SLE患者，均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ARA）修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，其中男性1例，女性25例，年齡18～56歲，平均年齡（27±6）歲。SLE患者給予氫化潑尼松聯(lián)合免疫抑制劑治療，分別于第4和12周采集患者靜脈全血。在門(mén)診選取16例健康人作為健康對(duì)照組，男性2例，女性14例，年齡20～50歲，平均年齡（25±5）歲。SLE組與健康對(duì)照組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 外周血NK細(xì)胞及其受體的檢測(cè) 采取對(duì)照組和治療前、治療后4及12周SLE患者的外周血，采用各種單抗染色劑流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血中CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率及其不同受體的表達(dá)率。每個(gè)采集管采集50μL血液，加入5μL單克隆抗體，包括FITC偶聯(lián)CD3單克隆抗體、APC偶聯(lián)CD56單克隆抗體、PerCP偶聯(lián)CD16單克隆抗體、PE偶聯(lián)NKG2D單克隆抗體、NKG2C單克隆抗體、NKp30單克隆抗體、NKp44單克隆抗體、NKp46單克隆抗體、NKG2A單克隆抗體、KIR2DL3單克隆抗體、KIR3DL1單克隆抗體、CD158a單克隆抗體、CD158b單克隆抗體（美國(guó)BD公司）。樣本在室溫下放置20～30min，之后加入FACS細(xì)胞裂解液（美國(guó)BD公司），靜置6min。用PBS緩沖液洗過(guò)2遍后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)分析軟件（v5.7.2）檢測(cè) CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率及其受體 NKG2C＋、NKG2D＋、NKP30＋、 NKP46＋、 KIR2DL3＋、 KIR3DL1＋、NKG2A＋、CD158a＋和CD158b＋的表達(dá)率。

1.3 外周血中IFN-γ＋CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率檢測(cè) 無(wú)菌管采集受檢者治療前及治療后4和12周外周血8mL，肝素抗凝，采用密度梯度離心法無(wú)菌分離制備單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×109L－1，加入濃度為50μg·L－1的PMA和1.0mg·L－1的離子霉素，將培養(yǎng)板放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中溫育2h，加入PBS的PBMCs作為對(duì)照組，加入1.0mg·L－1Brefeldin A（GolgiPlug，Becton Dickinson）的細(xì)胞額外孵育4h。用PBS緩沖液洗2次，洗滌后細(xì)胞內(nèi)染色：分別加入抗-CD56和抗-CD3mAbs（美國(guó)BD公司）及同型對(duì)照單抗，室溫溫育30min，同樣用PBS洗滌后加入4%的多聚甲醛100μL，室溫溫育30min，加入300μL的0.5%破膜劑和10%FBS固定液，經(jīng)過(guò)幾次PBS洗滌，加入PE偶聯(lián)抗-IFN-γ后放4℃冰箱備用。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中IFN－γ＋CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。受檢者外周血中CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率及其不同受體表達(dá)率以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 SLE患者外周血CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率及其受體表達(dá) 與健康對(duì)照組比較，治療前SLE患者外周血中CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率明顯降低（P＜0.05），其激活性受體NKG2C＋、NKP30＋和NKP46＋的表達(dá)率明顯增高（P＜0.05），抑制性受體KIR2DL3＋、KIR3DL1＋和NKG2A＋表達(dá)率均明顯降低（P＜0.05），而NKG2D＋、CD158a＋和CD158b＋的表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與治療前比較，治療4和12周后SLE患者外周血中CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率較治療前均明顯增高（P＜0.05）。治療4周后，NKG2C＋、NKP30＋及NKP46＋表達(dá)率較治療前明顯降低（P＜0.05），治療12周后上述受體的表達(dá)率較治療前進(jìn)一步降低（P＜0.05）。治療4周后，KIR2DL3＋、KIR3DL1＋及 NKG2A＋表達(dá)率較治療前明顯增高（P＜0.05），治療 12 周后KIR3DL1＋、CD158a＋、CD158b＋及 NKG2A＋的表達(dá)率較治療前均明顯增高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 SLE患者外周血中IFN-γ＋CD3－CD56＋NK細(xì)胞的比率 治療前SLE患者外周血中IFNγ＋CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率（28.050%±4.067%）與健康對(duì)照組（4.649%±1.995%）比較明顯增高（P＜0.001）；治療4和12周后，SLE患者外周血中IFN－γ＋CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率（7.545%±0.7265%和5.296%±1.399%）較治療前均明顯降低（P＜0.001）。

表1 各組受檢者外周血CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率及其不同受體表達(dá)率Tab.1 Ratios of CD3－CD56＋ NK cells in peripheral blood and expression rates of their different receptors of subjects in various groups （±s，η/%）

表1 各組受檢者外周血CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率及其不同受體表達(dá)率Tab.1 Ratios of CD3－CD56＋ NK cells in peripheral blood and expression rates of their different receptors of subjects in various groups （±s，η/%）

＊ P＜0.05compared with healthy control group；△P＜0.05compared with before treatment.

Group nRatio of CD3－CD56＋NK cells NKG2C＋ NKG2D＋ NKP30＋ NKP46＋0.562 16.600±2.530 13.950±1.360 SLE 26 Before treatment 1.690±0.203＊ 29.520±4.507＊ 93.580±2.406 45.070±3.616＊ 41.360±4.678＊4weeks after treatment 2.961±0.236△ 8.861±0.919△ 91.560±1.047 17.710±2.312△ 24.840±3.548△12weeks after treatment 8.920±0.939△ 9.896±1.651△ 88.370±2.153 23.330±4.546△ 19.140±2.195△Group n NKG2A＋ KIR2DL3＋ KIR3DL1＋ CD158a＋ CD158b＋Healthy control 16 27.220±3.169 30.340±15.708 15.77 Healthy control 16 9.306±1.283 13.130±3.584 86.570±0±1.303 22.010 ±2.798 19.540±3.849 SLE 26 Before treatment 5.659±1.311＊ 5.197±0.9154＊ 3.237±1.261＊ 11.220±2.597 10.820±1.592 4weeks after treatment 28.610±4.075△ 10.980±0.878△ 7.229±0.941△ 15.650±2.367 16.370±2.811 12weeks after treatment 38.690±3.406△ 28.760±3.266△ 17.160±2.641△ 24.270±1.925△ 18.900±2.496△

3 討 論

SLE是一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的自身免疫性疾病，免疫功能失調(diào)是其發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于大多數(shù)的SLE患者病情復(fù)雜，且變化較快，所以SLE的治療首選糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑。糖皮質(zhì)激素可以明顯地抑制免疫細(xì)胞的許多功能和免疫反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其對(duì)細(xì)胞免疫有突出的抑制作用；大劑量激素的應(yīng)用還對(duì)體液免疫有抑制作用，減少抗體產(chǎn)生；超大劑量激素的應(yīng)用有直接的淋巴細(xì)胞溶解作用。

CD3－CD56＋NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗病毒感染免疫、腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中起十分重要的作用[3]。本研究結(jié)果顯示：CD3－CD56＋NK細(xì)胞數(shù)量在SLE患者體內(nèi)明顯下降，與此前的研究[4－5]結(jié)果相似，其機(jī)制可能是SLE患者體內(nèi)存在較高水平的循環(huán)免疫復(fù)合物，這些循環(huán)免疫復(fù)合物可能是導(dǎo)致CD3－CD56＋NK細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞毒作用低下的重要原因[6]。同時(shí)，CD3－CD56＋NK細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致對(duì)自身抗體產(chǎn)生的抑制作用減弱，多種自身抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致SLE多臟器受損。本研究結(jié)果顯示：治療4和12周后CD3－CD56＋NK細(xì)胞的數(shù)量有所升高，提示SLE患者由于NK細(xì)胞的表達(dá)減少，使之對(duì)T、B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用減弱，并可能進(jìn)一步使T、B和NK細(xì)胞這3種重要的免疫細(xì)胞失去平衡，使SLE患者表現(xiàn)為整個(gè)免疫系統(tǒng)的紊亂；而應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療后，NK細(xì)胞的活性增高，主要通過(guò)釋放細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體免疫功能加以調(diào)節(jié)，可抑制B細(xì)胞的分化和增殖，同時(shí)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫起調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞表面存在識(shí)別靶細(xì)胞表面分子的活化受體和抑制受體，其對(duì)靶細(xì)胞是否發(fā)揮殺傷作用取決于活化與抑制性信號(hào)的綜合?；罨允荏w包括自然細(xì)胞毒受體NKp30、NKp46、NKp44、NKG2C、NKG2D 和一些活化相關(guān)的受體；抑制性受體主要包括C型凝集素家族的CD94-NKG2A及殺傷免疫球蛋白樣受體（KIR）如 KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DL1（即 CD158a） 和 KIR2DL2/KIR2DL3（即CD158b）等。正常情況下，CD3－CD56＋NK細(xì)胞的抑制性受體與正常細(xì)胞表達(dá)的HLAⅠ類(lèi)分子結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)性信號(hào)，即NK細(xì)胞失活，對(duì)自身抗體產(chǎn)生耐受，阻止CD3－CD56＋NK細(xì)胞對(duì)宿主自身正常細(xì)胞的殺傷作用。本研究結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組比較，SLE患者外周血CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率明顯降低；SLE患者激活性受體NKG2C＋、NKP30＋和NKP46＋的表達(dá)率明顯增高，抑制性受體KIR2DL3＋，KIR3DL1＋和NKG2A＋的表達(dá)率明顯降低；治療4和12周后NKG2C＋、NKP30＋和NKP46＋表達(dá)率較治療前明顯降低；而治療4周后KIR2DL3＋、KIR3DL1＋和NKG2A＋表達(dá)率較治療前明顯增高；治療12周后 KIR3DL1＋、CD158a＋、CD158b＋和NKG2A＋表達(dá)率較治療前亦明顯增高。上述結(jié)果與Herner等[7]的研究結(jié)果一致，表明SLE患者治療后較治療前激活性受體明顯降低，抑制性受體明顯增高，其機(jī)制可能是SLE患者外周血中CD3－CD56＋NK細(xì)胞識(shí)別自身HLAⅠ類(lèi)分子水平下降時(shí)，抑制性受體與HLAⅠ類(lèi)分子作用水平減低或不能與之結(jié)合，導(dǎo)致抑制CD3－CD56＋NK細(xì)胞活化的信號(hào)減弱或缺乏，啟動(dòng)活化性受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化信號(hào)，使CD3－CD56＋NK細(xì)胞活化，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，裂解靶細(xì)胞。而應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療后，可能CD3－CD56＋NK細(xì)胞的抑制性受體明顯增高，阻止其對(duì)宿主自身正常細(xì)胞的殺傷作用[8]，具體機(jī)制尚有待研究。IFN-γ是NK細(xì)胞活化后所分泌的重要效應(yīng)因子，主要在免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段發(fā)揮作用，同時(shí)也是一種典型的Th1型細(xì)胞因子，通過(guò)調(diào)節(jié)MHC－Ⅰ和MHC－Ⅱ類(lèi)分子在大多數(shù)免疫細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，提高細(xì)胞免疫，增強(qiáng)B細(xì)胞活化，消弱NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。本研究結(jié)果顯示：SLE患者IFN－γ＋CD3－CD56＋NK細(xì)胞比率與健康對(duì)照組比較明顯增高，這與先前的研究[9－11]結(jié)果一致；而在治療4和12周后較治療前均明顯降低，因此IFN-γ可能與 SLE患者的發(fā)病有關(guān)。有研究[7，12]表明：IFN-γ基因敲除的MRL-Faslpr小鼠其組織損傷和血清學(xué)特征均明顯減輕，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，證明IFN－γ在SLE發(fā)病中的作用至關(guān)重要。糖皮質(zhì)激素可以抑制IFN－γ的產(chǎn)生，故治療后IFN-γ較治療前減少，可能是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑后，導(dǎo)致CD3－CD56＋NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，抑制B細(xì)胞活化和多種自身抗體的產(chǎn)生。

綜上所述，利用FCM檢測(cè)SLE患者治療后CD3－CD56＋NK細(xì)胞及其受體表達(dá)的研究，對(duì)全面了解SLE患者治療前及治療后機(jī)體的免疫狀態(tài)變化情況有重要意義。在SLE的治療中，如進(jìn)一步了解上述細(xì)胞在SLE發(fā)病和治療中的作用，有利于SLE的治療，以期找到SLE治療的新靶點(diǎn)。

[1]李圣楠，黃慈波.系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷治療進(jìn)展 [J].臨床藥物治療雜志，2010，8，（1）：8-11.

[2]Hochberg MC. Updating the American college of rheumatology revised criteria for the classification of systemtic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum，1997，40（9）：1725-1730.

[3]James P，Disanto M.Functionally distinct NK-cell subsents；developmental origins and biological implications [J].Eur Immunol，2008，38（11）：2948-2951.

[4]Stetson DB，Mohrs M，Reinhardt RL，et al.Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer（NK）and NK T cells poised for rapid effector function [J].Exp Med，2003，198（7）：1069-1076.

[5]Erkeller-Yüsel F， Hulstaart F， Hannet I， et al.Lymphocyte subsets in a large cohort of patients with systemic lupus erythematosus [J].Lupus，1993，2（4）：227-231.

[6]Yabuhara A，Yang FC，Nakazawa T，et al.A killing defect of natural killer cells as an underlying immunologic abnormality in childhood systemic lupus erythematosus [J].J Rheumatol，1996，23（1）：171-177.

[7]Hervier B，Beziat V，Haroche J.Phenotype and function of natural killer cells in systematic lupus erythematosus：excess interferon-production in patients with active disease [J].Arthritis Rheum，2011，63（6）：1698-1706.

[8]Li WX，Pan HF，Hu JL，et al.Assay of T-and NK-cell subsets and the expression of NKG2Aand NKG2Din patients with new-onset systemic lupus erythematosus [J].Clin Rheumatol，2010，29（3）：315-323.

[9]Puxeddu I，Bongiorni F，Chimenti D，et al.Cell surface expression of activating receptors and co-receptors on peripheral blood NKcells in systemic autoimmune diseases[J].Scand J Reumatol，2012，41（4）：298-304.

[10]Yu J，Mao HC， Wei M，et al.CD94surface density identifies a functional intermediary between the CD56bright and CD56dim human NK-cell subsets [J].Blood，2010，115（2）：274-281.

[11]Henriques A， Teixeira L，Inês L，et al. NK cells dysfunction in systemic lupus erythematosus：relation to disease activity [J].Clin Rheumatol，2013，32（6）：805-813.

[12]Elkon KB，Wiedeman A.Type I IFN system in the development and manifestations of SLE [J].Curr Opin Rheumatol，2012，24（5）：499-505.