重組中國明對蝦溶菌酶包涵體的復(fù)性研究

張艷敏，李 成，武 瑤，梁雯靖，宋宛霖，姚 鵬，叢麗娜，劉志文

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

對蝦溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，可以與帶負電荷的病毒蛋白直接作用形成復(fù)合物，抵御侵入機體的病毒和細菌，是對蝦機體先天免疫系統(tǒng)中的重要防御因子[1]。與其他利用E.coli表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白一樣，重組對蝦溶菌酶在表達過程中也會形成不溶的、無生物活性的包涵體。目前，重組對蝦溶菌酶包涵體的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性等[2]。然而，關(guān)于重組蛋白復(fù)性后高回收率、高活性和高純度的報道不多，特別是層析法復(fù)性包涵體蛋白的研究較少。親和層析法復(fù)性包涵體蛋白不但可以實行純化和復(fù)性同時進行，同時固相介質(zhì)作為分子伴侶可以減少蛋白的錯誤折疊和聚合，并且可以實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)[3]。因此，本實驗運用稀釋復(fù)性和親和層析復(fù)性對重組對蝦溶菌酶包涵體進行處理，并對2種方法復(fù)性的重組蛋白進行比較，以期為進一步深入研究對蝦溶菌酶包涵體復(fù)性提供有益的借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌 種

重組中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)溶菌酶基因工程菌pET30a(＋)－FcLys／Rosetta(DE3)，由本實驗室構(gòu)建并保藏。

1.2 方 法

1.2.1 裂解菌體

挑取pET30a(＋)－FcLys／Rosetta(DE3)菌株，過夜活化后，按1%的接種量接種于含100μg／mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160r／min培養(yǎng)至OD600達0.6～0.7(約3h)，加入0.5mmol／L IPTG，低溫(28℃)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。離心收集菌體并于－20℃凍管保存。

用含有1%Triton X－100的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸凍融后的菌體，將其置于冰浴中超聲破碎(功率300W；破碎／間隔1s／3s)5min左右。低溫高速離心，使大多數(shù)包涵體沉淀與可溶性蛋白分離，收集沉淀，棄上清液。

1.2.2 洗滌包涵體

由于脂體及破碎的部分細胞膜及膜蛋白與包涵體沉淀粘連在一起，在溶解包涵體沉淀之前，一定要洗滌包涵體。在洗滌緩沖液(50mmol／L Tris－HCl，0.5mol／L NaCl，2%Triton X－100，2mmol／L EDTA，2mol／L 尿素，pH 8.0)中，超聲洗滌包涵體沉淀(超聲功率300W，破碎／間隔1s／3s)約 5min。低溫高速離心(4 ℃，12 000r／min)，棄上清，取沉淀。重復(fù)此步驟，將沉淀在洗滌緩沖液中再洗滌一次。

1.2.3 溶解包涵體

將洗滌后的包涵體加入到20mL溶解緩沖液 中 (50mmol／L Tris－HCl，8mol／L 尿 素，0.5mol／L NaCl，2mmol／Lβ－巰基乙醇)，于搖床上25℃、100r／min震動溶解4h，然后經(jīng)4℃、12 000r／min離心10min，取上清，即得FcLys包涵體溶解液。

1.2.4 包涵體的稀釋復(fù)性

取一定量的包涵體溶解液，加入不含尿素的包涵體復(fù)性緩沖液 (50mmol／L Tris－HCl，0.5mol／L NaCl，2mmol／L β－巰基乙醇，1mmol／L谷胱甘肽，0.2mmol／L氧化性谷胱甘肽，1mmol／L CaCl2)，將體系中尿素的濃度稀釋到4mol／L，將該反應(yīng)置于4℃靜止8h。再加入復(fù)性緩沖液將體系的尿素濃度降至3mol／L，并于4℃靜止8h。最后再加入復(fù)性緩沖液將尿素濃度降至2mol／L，同樣置于4℃靜止8h。將該復(fù)性液放入透析袋中依次在不含尿素的復(fù)性緩沖液中和PBS中透析處理。

1.2.5 包涵體的親和層析復(fù)性

將5倍柱體積的結(jié)合緩沖液(20mmol／L Na3PO4，0.5mol／L NaCl，20mmol／L 咪唑，pH 8.0)以1mL／min的體積流量通過1mL的Ni2＋親和層析柱來平衡柱子。將包涵體溶解液經(jīng)0.45μm濾膜過濾除去大分子雜質(zhì)，以體積流量0.5mL／min經(jīng)過被結(jié)合緩沖液結(jié)合過的柱子。再分別用含4、3、2mol／L尿素的復(fù)性緩沖液依次通過Ni2＋柱，以體積流量0.5mL／min各流經(jīng)柱子4h，使重組蛋白在Ni2＋柱上復(fù)性。用洗脫緩沖液(500mmol／L 咪唑，50mmol／L Tris－Hcl，300mmol／L NaCl)以體積流量1mL／min將目的蛋白從親和層析柱上洗脫下來。將收集到樣品在PBS中透析處理。

1.2.6 親和層析復(fù)性的條件優(yōu)化

1.2.6.1 蛋白上樣量對復(fù)性的影響

分別取0.1、0.2、0.4、0.6mL包涵體變性溶液上樣，復(fù)性緩沖液體積流量為0.5mL／min，復(fù)性后用0.5mol／L咪唑緩沖液進行洗脫，洗脫液在PBS緩沖液中透析，Bradford法測蛋白濃度。

1.2.6.2 復(fù)性液pH對復(fù)性的影響

取200μL變性蛋白溶液上樣，復(fù)性緩沖液體積流量為0.5mL／min。復(fù)性液pH選為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。復(fù)性后按照“1.2.6.1”方法進行洗脫、透析、測蛋白濃度。

1.2.6.3 溫度對復(fù)性的影響

取200μL變性蛋白溶液上樣，復(fù)性緩沖液體積流量為0.5mL／min，復(fù)性溫度選在10、25℃。復(fù)性后按“1.2.6.1”方法進行洗脫、透析、測蛋白濃度。

1.2.7 分析方法

蛋白濃度根據(jù)Bradford法進行測定[4]。通過Bandscan 5.0軟件分析蛋白純度。

1.2.8 復(fù)性蛋白的生物活性檢測

取本實驗室保存的革蘭陽性菌溶壁微球菌(M.lysodeikticus)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭陰性菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為指示菌，用透析液PBS作為對照，采用瓊脂平板擴散法[5]檢測復(fù)性重組蛋白FcLys的抑菌活性。在制備好的瓊脂平板上放置牛津杯，牛津杯中加入0.2mL透析后的重組蛋白FcLys，將平板放在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，實驗重復(fù)3次，測量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 包涵體的收集和洗滌

發(fā)酵完成后，菌體經(jīng)離心、沉淀被超聲破碎，再次離心，經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測，上清液中無明顯的重組FcLys蛋白(圖1Line 3)，重組FcLys蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中(圖1Line 4)。本實驗采用 Triton X－100、EDTA 和尿素聯(lián)合洗滌法，經(jīng)2次洗滌，有效地去除了包涵體中的雜質(zhì)，如脂類、脂多糖、核酸、雜蛋白等，提高了目的蛋白純度，有利于之后的復(fù)性過程。同時，隨著洗滌次數(shù)的增加，目的蛋白的損失量也越來越多，因此要根據(jù)實際情況確定適宜的洗滌次數(shù)。

圖1 重組FcLys蛋白的表達及洗滌Fig.1 Expression and washing of recombinant FcLys

2.2 復(fù)性方法比較

通過稀釋復(fù)性和親和層析復(fù)性對包涵體進行處理，得到復(fù)性成功的重組蛋白FcLys，電泳檢測如圖2(Line 2，Line 3)。根據(jù)Bradford法來測定蛋白濃度從而得出蛋白回收率，通過Bandscan軟件來分析蛋白純度。由表1可知，親和層析復(fù)性得到的FcLys蛋白在蛋白純度和蛋白回收率方面明顯優(yōu)于稀釋復(fù)性。

圖2 復(fù)性后重組FcLys蛋白SDS－PAGE檢測Fig.2 Identification of recombinant FcLys by SDS－PAGE

表1 FcLys蛋白2種復(fù)性方法的比較Tab.1 Comparison of two methods of FcLys protein refolding

2.3 復(fù)性包涵體蛋白的生物活性檢測

通過表2可知，經(jīng)稀釋復(fù)性和親和層析復(fù)性得到的重組蛋白FcLys對革蘭陽性菌溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，對革蘭陰性菌則無抑菌效果。而作為對照的透析液PBS對所有指示菌均沒有抑菌效果。親和層析復(fù)性得到的重組蛋白對金黃色葡萄球菌的活性要比稀釋復(fù)性得到的重組蛋白的活性高26.3%，并且對溶壁微球菌的抑菌活性，前者比后者高25%。

表2 重組FcLys蛋白抑菌活性檢測Tab.2 Antimicrobial activities of the recombinant FcLys

2.4 親和層析復(fù)性影響蛋白回收率的因素

2.4.1 蛋白上樣量對復(fù)性的影響

當(dāng)上樣量為0.1、0.2、0.4、0.6mL時，蛋白的回收效率分別為36.2%、22%、16%和12%。由此可見，隨著上樣量的增加，復(fù)性蛋白回收率降低。因在親和層析柱上的蛋白，在復(fù)性過程中會形成聚集體，隨著蛋白濃度增加，聚集機會增大，導(dǎo)致復(fù)性效率會降低。蛋白上樣量越低，越有利于復(fù)性，但濃度過低，不利于蛋白的回收，并影響產(chǎn)量，應(yīng)用中要根據(jù)實際情況選擇合適的上樣量。

2.4.2 復(fù)性液pH對復(fù)性的影響

如圖3，包涵體復(fù)性的最適pH為8.0左右。偏中性條件下，重組蛋白中半胱氨酸側(cè)鏈上的巰基較穩(wěn)定，不利于二硫鍵形成。實驗表明，弱堿環(huán)境有利于包涵體復(fù)性，但過高的pH又會加快二硫鍵的形成，導(dǎo)致錯配，形成沉淀，降低回收效率。

圖3 pH對蛋白回收率的影響Fig.3 Effect of pH on the yield of the recombinant FcLys refolding

2.4.3 溫度對復(fù)性的影響

在10℃復(fù)性時，蛋白回收率為24.5%，在25℃復(fù)性時，蛋白回收率為33.6%。說明溫度越高，復(fù)性效率就越好。因為蛋白和固相介質(zhì)結(jié)合，即使溫度升高，分子運動也受到限制，不會像稀釋復(fù)性那樣易形成聚集體，提高溫度，加快了復(fù)性速度，從而提高復(fù)性效率。但溫度不能超過酶的最適溫度，否則酶會發(fā)生不可逆變性，從而失去活性。

3 結(jié) 論

中國明對蝦溶菌酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，主要以包涵體形式表達。經(jīng)含有8mol／L尿素的溶解緩沖液處理后，F(xiàn)cLys包涵體變性溶解。通過比較稀釋復(fù)性法和親和層析復(fù)性法對包涵體復(fù)性產(chǎn)率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親和層析復(fù)性明顯優(yōu)于稀釋復(fù)性，具有更高的蛋白復(fù)性產(chǎn)率，并且得到的可溶性蛋白回收率也要高于許多相關(guān)蝦類文獻報道(表3)。在親和層析復(fù)性實驗中，通過優(yōu)化了上樣量、pH和溫度3種因素發(fā)現(xiàn)，較低濃度的蛋白復(fù)性液在pH 8.0的緩沖體系下，降低上樣量并提高環(huán)境溫度，會有效提高復(fù)性效率。親和層析復(fù)性得到高純度、可溶的重組對蝦溶菌酶蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌均具有高效的抑菌活性。這些結(jié)果為進一步研究對蝦溶菌酶的性質(zhì)和功能奠定了基礎(chǔ)。

表3 相關(guān)對蝦溶菌酶包涵體研究的比較Tab.3 Comparison of inclusion body of shrimp lysozymes

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