片形吸蟲成蟲蟲體抗原制備及ELISA實驗研究

陳 鳳，李科榮，楊 敬，郝明明，羅家軍，劉榆華

（大理州血吸蟲病防治研究所，云南大理 671000）

片形吸蟲為家畜常見的寄生蟲，在分類上隸屬于吸蟲綱復殖目片形科（Fasciolidae）片形屬（Fasciola），在我國主要分布有兩種：肝片形吸蟲（Fasciola hepatica）和大片形吸蟲（F.gigantica），蟲體寄生于牛羊等反芻動物的肝臟膽管中，也寄生于人體〔1〕。片形吸蟲病（Fascioliasis）是由片形吸蟲（Fasciola spp.）感染引起的人獸共患病〔2〕，片形吸蟲在世界各地均有流行，主要在歐州，亞洲的人體感染病例較少〔3-6〕，國內對人體片形吸蟲病的報道不多，至2007年國內共報道224例片形吸蟲病病例，多為散發(fā)，且以流行病學調查方式發(fā)現(xiàn)的病例占多數(shù)〔7-9〕。至2012年1月云南省賓川縣爆發(fā)大片形吸蟲病〔10〕，片形吸蟲才成為大理地區(qū)較為關注人體寄生蟲病之一。由于片形吸蟲在人體組織移行期較長，免疫學檢測在早期診斷尤為重要，但目前市場上用于片形吸蟲病檢測的試劑盒主要是德國DRG公司生產的肝片吸蟲病ELISA檢測試劑盒，國內還沒有成品的商品試劑盒問世〔11〕。為探索片形吸蟲病檢測方法或試劑，建立適用于基層的檢測系統(tǒng)，以期用于寄生蟲病爆發(fā)時疫情處置及協(xié)助臨床診斷疑難寄生蟲病例，我們選擇試用云南大理本地的片形吸蟲成蟲蟲體可溶性粗抗原，建立ELISA（FAWA-ELISA）檢測法對本地感染的片形吸蟲病例進行檢測，于2013年8月至2014年1月在大理州血吸蟲病防治研究所中心實驗室進行了相關實驗，取得較滿意的效果，現(xiàn)將實驗過程及結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 片形吸蟲 牛體片形吸蟲成蟲采自大理市農貿市場牛肝膽管，形態(tài)學初步鑒定為肝片形吸蟲。

1.2 血清 大片吸蟲病患者血清共26份，為2012年流調時同期采集的患者血清，其中1份為經病原學診斷的確診患者血清，其余為臨床診斷病例。其他寄生蟲病患者血清共102份，其中斯氏貍殖吸蟲病血清3份（病理學確診）、慢性血吸蟲病血清24份（病原學確診）、急性血吸蟲病20份（病原學確診）、旋毛蟲病患者血清21份（全部為臨床診斷患者血清）、囊蟲病患者血清21份（全部均通過影像學確診，其中混合型囊蟲病例6例、腦囊蟲病15例）、廣州管圓線蟲病例12份（全部為臨床診斷病例）、包蟲病病例1例（手術確診），所有血清均來自本所血清庫。健康人血清共25份，來自本所血清庫。

1.3 試劑和儀器

1.3.1 試劑 96孔酶標板購自浙江拱東醫(yī)用塑料廠，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人IgG（HRP-IgG）、牛血清白蛋白（BSA）購自美國SIGMA公司，TMB顯色液購自中國TIANGEN公司。

1.3.2 儀器 DNM-9602型酶標儀購自北京普朗公司；TM-01100-26型數(shù)字恒溫電熱恒溫培養(yǎng)箱購自美國BOOKEL公司；微量移液器購自德國BRAND公司；TU-1800PC紫外分光光度計購自北京普析公司。

1.3.3 抗原的制備 參照文獻〔12〕并結合本所實驗室條件進行制備。取牛體片形吸蟲成蟲加PBS或生理鹽水在冰上研磨至勻漿，分裝到1.5 mL離心管8000 r/min，4℃離心10 min，取上清液轉移至另一支離心管，重復8000 r/min，4℃離心10 min，取上清液即為蟲體抗原，測蛋白濃度備用。用紫光分光光度法測得蛋白含量為17 mg/mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 ELISA操作 方法參照文獻〔11〕并進行了一些改進，實驗所用包被液、稀釋液、洗滌液等均為我所自行配制（配方略）。以棋盤滴定的方式尋找到酶結合物工作濃度為1：10000時的最適抗原濃度為20 μg/mL，將制備好的成蟲可溶性抗原分別用0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋成20 μg/mL，每孔100 μL包被96孔酶標板，4℃過夜，1%BSACB封閉液200 μL/孔37℃封閉2 h，用含0.05%吐溫20的PBS（PBST）洗板4次，每次靜置3 min。拍干，加1：100待檢血清100 μL（用1%BSA-PBST 稀釋），37℃ 1 h，用PBST洗滌4次，每次靜置3 min，加HRP-IgG 100 μL（用1%BSA-PBST 稀釋），37℃，0.5 h，PBST洗滌4次，每次靜置3 min，加TMB顯色液室溫避光孵育5 min，2 mol/L H2SO4液終止反應，用酶標儀測定吸光度（A450nm為測量波長，A630nm為參比波長）。每板設兩孔空白對照、兩孔陰性對照、兩孔陽性對照。根據重復測定陽性參考血清及陰性血清A值，確定閾值，計算實驗的敏感度特異度及交叉反應率。并對實驗的重復性、穩(wěn)定性（精確度）進行測試。以下簡稱FAWA-ELISA檢測法。

1.4.2 樣本檢測 分別用上述方法檢測26份大片吸蟲病患者血清（P1-P26）、102份其他患者血清和25份健康人血清。其中，P1-P6為精密度樣品。

1.4.3 數(shù)據分析 采用Microsoft Office Excel 2003結合SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，計算A/CO值，以及診斷試驗的各種評價指標。

2 結果

2.1 精確度（重復性）比較 FAWA-ELISA檢測大片吸蟲病患者精密度血清樣品P1-P6，以中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所大片吸蟲試劑盒檢測血清抗體滴度為高（P1-P2）、中（P3-P4）、低（P5-P6）血清樣本的均數(shù)、標準差、變異系數(shù)見表1，其批內變異、批間變異（CV）均＜15%，表明試劑精密度、重復性較好，可應用于實驗研究。

2.2 CUT-OFF值的確定 為選擇適合的截斷點作為陰陽性的分界，我們以吸光度A值作為診斷指標尋找截斷點（CUT-OFF值），選取ROC曲線坐標值作為參考，ROC曲線坐標顯示，當截斷點取A值為0.344的時候，約登指數(shù)等于0.992，為最高值，此后逐漸下降，但結合目測結果，通常ELISA實驗陰性參考A值大于0.12肉眼即出現(xiàn)可見微藍，陰參A值大于0.15一般視為實驗無效，故CUT-OFF取值以陰參值在0.06～0.15之間時所設值較合理，否則在沒有酶標儀的情況下無法目測判定結果；陰參值在0.06～0.15之間時2.1倍陰參作為臨界值的取值范圍為（0.126～0.315），此范圍內確立的截斷點其約登指數(shù)在0.89～0.99之間，故我們以空白調零樣品孔A值＞陰性對照A值均數(shù)的2.1倍作為陽性結果的閾值（CO），此閾值設定較適于不同批次、不同實驗室、不同現(xiàn)場的應用，并以此計算實驗的敏感度、特異度及交叉反應率。見表2。

表1 FAWA-ELISA法檢測大片吸蟲病患者血清精密度

表2 FAWA-ELISA不同截斷點時的敏感度、特異度

2.2.1 ELISA實驗結果 FAWA-ELISA檢測26例大片形吸蟲病例全部陽性，陽性率100%（26/26），其他寄生蟲病及健康人交叉反應陽性分別如下：急性血吸蟲病患者交叉陽性率為5%（1/20）、慢性血吸蟲病患者4.17%（1/24）、旋毛蟲病患者4.76%（1/21），與斯氏貍殖吸蟲病患者血清交叉陽性率為100%（3/3）、廣州管圓線蟲0%（0/12）、囊蟲0%（3/21）、包蟲0%（0/1），健康人0%（0/25）。見表3。

表3 FAWA-ELISA法檢測大片吸蟲病人、其他寄生蟲病患者及健康人血清結果

2.2.2 敏感性和特異性 由表3可得出FAWAELISA檢測法的敏感性為100.0%，特異性為95.28%（95%CI：98.9%～91.2%）、陽性預測值為81%（95%CI：94.7%～67.7%）、陰性預測值為100%，陽性似然比為21.17，陰性似然比0，約登指數(shù)為0.95。

2.2.3 A值比較 FAWA-ELISA對片形吸蟲病例檢出率為100%（26/26），與文獻〔11〕報告檢測的檢出率一致（血清為云南賓川爆發(fā)時采集的同一批病例血清）；且通過酶標儀進行A值結果判讀分析，片形吸蟲病例血清的A值均值為0.523，交叉反應陽性血清A值均值為0.226，片形吸蟲病例血清陽性A值明顯高于交叉反應陽性A值（t=6.7，P ＜0.01），F(xiàn)AWA-ELISA檢測26例大片吸蟲病患者血清的A/CO均值為3.29，明顯高于交叉反應陽性血清A/CO均值1.56（t=6.07，P ＜ 0.01），也明顯高于文獻〔11〕Fg-ELISA的1.7（t=15.12，P ＜ 0.0001），各血清組A值見圖1。

3 討論

我國多數(shù)省都有兩種片形吸蟲存在〔13〕，2012年云南賓川地區(qū)片形吸蟲感染調查也證實了這一點〔14〕。片形吸蟲的成蟲和蟲卵在形態(tài)上者較難區(qū)分，鑒定片形吸蟲的種類還需要分子生物學的方法予以輔助〔14〕。我們制備抗原的片形吸蟲從形態(tài)學上初步鑒定為肝片形吸蟲，但由于實驗室條件限制沒有進行分子生物學鑒定，故在實驗上無法準確區(qū)分判定為大片吸蟲還是肝片吸蟲。通過文獻研究了解到大片吸蟲粗抗原與肝片吸蟲粗抗原的蛋白成分基本相同〔15〕，且大片吸蟲和肝片吸蟲感染后所造成的臨床損害與治療方法均一致〔13〕，故我們認為不影響FAWA-ELISA檢測方法的使用，在基層有限的條件下可以先篩檢出病人救治病人之后再以上級機構專業(yè)的試劑盒鑒定為何種片形吸蟲感染，再結合分子生物學方法進行確診。同時，通過本次實驗我們再次驗證了賓川暴發(fā)的片形吸蟲病例的血清，得出與文獻〔10〕一致的結果（26例片形吸蟲病例陽性率100%），通過重復試驗也確定了這次疫情診斷的準確性，如果有相似疫情暴發(fā)，我們可以用該方法協(xié)助診斷。

圖1 FAWA-ELISA試劑盒檢測大片吸蟲病、其他寄生蟲病患者及健康人血清結果比較

FAWA-ELISA檢測方法的敏感性分別為100.0%，特異性分別為95.28%，與文獻〔11〕報道的較好的片形吸蟲病檢測方法Fg-ELISA相比，敏感性、特異性與Fg-ELISA一致（u=0.46，P ＞0.05），且通過酶標儀進行A值結果判讀分析，F(xiàn)AWA-ELISA檢測26例大片吸蟲病患者血清的A/CO均值為3.29，明顯高于文獻〔11〕Fg-ELISA的1.7（t=15.12，P ＜ 0.0001），這是否是由于用本地牛體片形吸蟲制備的抗原對于本地感染的片形吸蟲病例免疫原性更好還有待研究，但至少可以說明我們建立的FAWA-ELISA同樣適于片形吸蟲病流行區(qū)進行大規(guī)模的初步篩查應用。

FAWA-ELISA檢測方法的陽性預測值分別為81.25%，陰性預測值分別為100%，說明檢測時不易出現(xiàn)漏檢的情況，但出現(xiàn)假陽性的概率較大，尤其是在血清質量較差的情況下。在與其他寄生蟲病患者血清交叉反應的觀察中，發(fā)現(xiàn)本次實驗結果與文獻〔11，16〕報告的較一致，即片形吸蟲抗原與其他吸蟲（主要是肺吸蟲）交叉反應較大而與線蟲、絳囊蟲交叉較小，與急性血吸蟲病患者血清交叉陽性率分別為5%（1/20）、慢性血吸蟲病患者4.17%（1/24）、旋毛蟲病患者4.76%（1/21），與斯氏貍殖吸蟲病患者血清交叉陽性率為100%（3/3），與囊蟲包蟲交叉反應為0（0/22）。表明該方法在區(qū)分吸蟲類寄生蟲感染，尤其是并殖吸蟲感染時意義不大，這可能與吸蟲同類之間交叉抗原有關。但由于云南是華支睪吸蟲的流行區(qū)但尚未發(fā)現(xiàn)本地感染華支睪吸蟲病病例故暫不是華支睪吸蟲病流行區(qū)，而且大理州除劍川縣外也不是肺吸蟲流行區(qū)，大理州內也尚未發(fā)現(xiàn)本地感染的肺吸蟲病例〔17〕，故可排除在大理本地感染肺吸蟲與華支睪吸蟲的可能性；而與片形吸蟲同屬片形科的布氏姜片吸蟲感染由于沒有肝部表現(xiàn)可通過（CT、MRI、彩超）等區(qū)別；片形吸蟲和血吸蟲在大理州流行區(qū)有可能交叉，但也可通過流行病學史、臨床表現(xiàn)和輔助檢查（CT、MRI、彩超等）可區(qū)分血吸蟲與片形吸蟲感染。同時FAWA-ELISA實驗的陽性似然比為27.17，陰性似然比為0，說明FAWA-ELISA實驗判斷為陽性時是病人的可能性是健康人的27倍，F(xiàn)AWA-ELISA實驗判斷為陰性時是病人的可能性幾乎為0，結合臨床分析可協(xié)助診斷。且發(fā)現(xiàn)片形吸蟲病例血清陽性A值明顯高于交叉反應陽性A值（t=6.7，P＜0.001），通過酶標儀測定A值，在報告陰陽性同時報告A/CO值，可以提高報告的準確性。

所以用此條件建立的片形吸蟲ELISA方法可以試用于大理州乃至云南省片形吸蟲流行病學調查，以血清學進行過篩，再結合糞檢進行查病，可大大減輕糞檢的工作量。在沒有更好的片形吸蟲病檢測方法或成品試劑盒問世之前還可試用于片形吸蟲疑似病例的臨床樣本檢測參考。

致謝：感謝中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所許學年、周巖、程娜老師，感謝中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所；感謝大理州血吸蟲病防治研究所方文主任醫(yī)師對本實驗提供的幫助。

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