炎癥相關(guān)趨化因子/細(xì)胞因子在香煙暴露和戒煙小鼠肺組織中的表達(dá)

李久榮，周煒洵，趙召霞，高金明

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科 2病理科，北京 100730 3石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050021

炎癥相關(guān)趨化因子/細(xì)胞因子在香煙暴露和戒煙小鼠肺組織中的表達(dá)

李久榮1，周煒洵2，趙召霞3，高金明1

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1呼吸內(nèi)科2病理科，北京 1007303石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050021

目的觀察香煙暴露及戒煙后小鼠肺組織炎癥以及炎癥相關(guān)趨化因子及細(xì)胞因子表達(dá)的情況。方法將18只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、香煙暴露組及戒煙組3組，每組6只。測(cè)量小鼠氣道阻力，HE和Masson染色觀察肺部形態(tài)及炎癥情況，計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液 (BALF)中炎癥細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類數(shù)，采用實(shí)時(shí)PCR方法及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠肺組織中CXCL9、CXCL10、CXCL11、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)2、MMP9、MMP12及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的mRNA及蛋白表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)量BALF上清中CXCL9、CXCL10、CXCL11、白細(xì)胞介素 (IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TGF-β1水平。結(jié)果香煙暴露組小鼠氣道阻力 (Rn)顯著高于正常對(duì)照組 (P＜0．01)，戒煙組Rn亦顯著高于正常組 (P＜0．05)。與正常對(duì)照組比較，香煙暴露組與戒煙組肺組織病理總評(píng)分均顯著增高 (P＜0．001)。香煙暴露組和戒煙組的炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組 (P＜0．001)。香煙暴露組和戒煙組CXCL9、CXCL10、MMP9和MMP12的mRNA水平均顯著高于正常對(duì)照組 (P均＜0．05)。香煙暴露組和戒煙組CXCL9、CXCL10、CXCL11、MMP2、MMP9、MMP12及TGF-β1的蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組 (P均＜0．05)。與正常對(duì)照組比較，香煙暴露組和戒煙組BALF上清中的CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-8及TGF-β1濃度顯著增加 (P均＜0．05)，香煙暴露組IL-6和TNF-α濃度亦顯著升高 (P均＜0．05)。結(jié)論香煙暴露引起炎癥細(xì)胞在肺組織中聚集及炎癥細(xì)胞因子升高，戒煙后炎癥細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子盡管有所下降，但仍高于正常對(duì)照。戒煙后肺部炎癥持續(xù)存在，趨化因子受體CXCR3的配體可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

CXCR3配體;香煙煙霧;戒煙;肺部炎癥

CXCR3受體主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、自然殺傷 (natural killer，NK)細(xì)胞及樹突細(xì)胞等細(xì)胞表面，是一種炎性趨化因子受體［1-2］。CXCR3受體有3種配體。分別是干擾素-γ誘生單核因子(monokine induced by interferon gamma，MIG)/CXCL9、干擾素誘導(dǎo)蛋白 10(IFN-γ-inducible protein of 10，IP10)/CXCLl0、干擾素-γ誘導(dǎo)的T細(xì)胞α趨化因子(IFN-γ-inducible T-cell-α chemoattractant，I-TIC)/CXCLl1。CXCR3受體與其配體結(jié)合后，能夠趨化粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺部聚集［3-4］。本課題組以往研究結(jié)果顯示，CXCR3-/-基因敲除小鼠香煙暴露后的肺部炎癥及肺損傷較野生型組明顯減輕，表明CXCR3及其配體在肺部炎癥及肺損傷中起到重要作用［5-6］。

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種慢性氣道炎癥性疾病，其特點(diǎn)為氣流受限不完全可逆。眾所周知，吸煙是引起COPD的主要原因，戒煙是目前公認(rèn)的治療COPD的有效措施，但大部分COPD患者戒煙后氣道炎癥仍持續(xù)存在［7］，氣流受限不可逆且呈進(jìn)行性發(fā)展，其中的機(jī)制目前尚不清楚。鑒于前期實(shí)驗(yàn)顯示CXCR3及其配體在香煙誘導(dǎo)肺部炎癥及肺損傷中的作用，本研究擬觀察CXCR3的配體在戒煙小鼠模型肺部炎癥中的作用，并探討其可能的機(jī)制。

材料和方法

材料 雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠18只 (北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物中心)，鼠齡8～10周，體重20～25 g。3R4F香煙 (美國(guó)肯塔基大學(xué)，每支香煙含有10．9 mg顆粒物質(zhì)，9．4 mg焦油，0．726 mg尼古丁)。Realtime PCR試劑盒 (日本 Takara公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，引物設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒 (美國(guó)R＆D Systems公司)，免疫組織化學(xué)一抗 (美國(guó)Abgent公司，英國(guó) Biorbyt公司)，Real-time PCR儀器(美國(guó) Life Technologies公司)，光學(xué)顯微鏡 (日本OLYPUMS公司)。小動(dòng)物呼吸機(jī) (flexiVent，加拿大SCIREQ公司)。

動(dòng)物分組及模型建立小鼠在清潔環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，采用抽簽法隨機(jī)分為正常對(duì)照組 (n=6)、香煙暴露組 (n=6)和戒煙組 (n=6)。參照文獻(xiàn) ［8］的方法建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。自制有機(jī)玻璃艙 (50 cm× 50 cm×30 cm)，玻璃艙有小孔與外界相通，保持常壓狀態(tài)，小鼠在艙內(nèi)可自由飲水和活動(dòng)。正常對(duì)照組小鼠暴露于正常空氣，除香煙暴露外其他條件同香煙暴露組;香煙暴露組小鼠每天置于艙內(nèi)香煙暴露，每次5支香煙，每天4次，間隔30 min，連續(xù)暴露3 d，第3天香煙暴露后2 h處死小鼠;戒煙組小鼠前3 d條件同香煙暴露組，第4天起暴露于正?？諝猓?周后處死小鼠。

小鼠氣道阻力測(cè)量腹腔注射 2%戊巴比妥(80 mg/kg)麻醉小鼠，暴露氣管，用20 g靜脈留置套管針插入氣道，連接由電腦控制的小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率設(shè)為150次/min，潮氣量為10 ml/kg，腹腔注射肌松藥羅庫(kù)溴銨 (1 mg/kg)，機(jī)械通氣2 min后，測(cè)量小鼠氣道的阻力 (Rn)。

肺組織病理評(píng)分用10%多聚甲醛經(jīng)氣道沖洗右肺，由距肺門3 mm左右處取出肺組織，放在盛有10%多聚甲醛的容器中浸泡24 h，切片 (5 μm/片)后HE和Masson染色。對(duì)小鼠小氣道6項(xiàng)指標(biāo)及肺實(shí)質(zhì)炎癥和肺氣腫進(jìn)行病理學(xué)觀察并評(píng)分［9］，評(píng)分指標(biāo)包括：(1)小氣道阻塞;(2)上皮損傷;(3)上皮杯狀細(xì)胞化生;(4)小氣道壁及肺實(shí)質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn); (5)鱗狀上皮化生; (6)膠原沉積; (7)肺氣腫。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常0分，輕度異常1分，中度異常2分，重度異常3分。每張切片取6個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算平均值，將7項(xiàng)指標(biāo)的平均分值相加，即為該樣本的病理評(píng)分總分。

支氣管肺泡灌洗肺功能測(cè)試完后，將20 g靜脈留置套管針插入氣管約5 mm，用1 ml注射器抽吸1 ml生理鹽水，經(jīng)套管針緩緩注入氣管，停留30 s后將生理鹽水緩緩回抽，可見回抽出帶乳白色泡沫狀液體，重復(fù)灌洗2次，每次回抽出0．8～0．9 ml。將支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)轉(zhuǎn)移至離心管中，1500 r/min(r=13．5 cm)離心5 min，取上清液用于細(xì)胞因子檢測(cè)。細(xì)胞沉淀經(jīng)1 ml生理鹽水重懸后，滴10 μl懸浮液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)算總細(xì)胞數(shù)。剩余懸浮液用甩片機(jī)甩片，在無(wú)菌操作臺(tái)中風(fēng)干后，用75%乙醇固定，HE染色，進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

實(shí)時(shí)PCR用勻漿器將適量左肺組織勻漿后 (冰上操作)，加入1 ml Trizol，提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用real-time試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：95℃ 30 s;95℃5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)CXCL9、CXCL10、CXCL11、基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMP)2、MMP9、MMP12及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的 mRNA表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR的引物序列Table 1 The primer sequences of real-time polymerase chain reaction

免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法檢測(cè)肺組織中CXCL9、CXCL10、CXCL11、MMP2、MMP9、MMP12及TGF-β1的蛋白表達(dá)水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。肺組織切片用二甲苯脫蠟3次;乙醇梯度乙醇下行至水，置于3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min，用PBS洗2次;微波修復(fù)抗原5 min，用PBS洗2次;10%正常山羊血清封閉，室溫孵育20 min。滴加相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜，用PBS洗3次;滴加生物素化第二抗體 (IgG)，37℃20 min，切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃20 min，用PBS洗3次;加DAB溶液顯微鏡下顯色約3～4 min，自來(lái)水沖洗;蘇木素復(fù)染胞核;常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：每張切片選取5個(gè)具有代表性的高倍視野 (10×40倍)。染色強(qiáng)度為 (-)、(±)、(+)、(++)至 (+++)，依次記為0、1、2、3、4分［10］。

ELISA法采用ELISA法測(cè)定BALF上清中的相關(guān)因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、白細(xì)胞介素 (interleukin，IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及TGF-β1水平，按試劑盒說(shuō)明操作。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad 6．0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

小鼠氣道阻力香煙暴露組小鼠氣道阻力較正常對(duì)照組顯著增加 ［(0．67±0．08)cmH2O·s/ml比(0．52±0．03)cmH2O·s/ml，P＜0．01］，戒煙組小鼠氣道阻力亦顯著高于正常對(duì)照組 ［(0．65±0．12) cmH2O·s/ml比 (0．52±0．03)cmH2O·s/ml，P＜0．05］。戒煙組與香煙暴露組氣道阻力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)。

肺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果光鏡下可見香煙暴露組出現(xiàn)上皮損傷、小氣道壁及肺實(shí)質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、鱗狀上皮化生以及膠原蛋白沉積，戒煙組中上述改變均有所減輕;各組均未發(fā)現(xiàn)明顯小氣道阻塞、杯狀上皮化生及肺氣腫 (圖1)。香煙暴露組和戒煙組與正常對(duì)照組比較，肺組織病理學(xué)總評(píng)分均顯著增高 (4．83± 1．47比1．33±0．52，4．17±0．75比1．33±0．52，P均＜0．001);戒煙組與香煙暴露組病理學(xué)總評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)。

BALF細(xì)胞總數(shù)及分類香煙暴露組的炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組 (P＜0．001);戒煙組炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著低于香煙暴露組 (P＜0．001)，但仍顯著高于正常對(duì)照組 (P＜0．001)。香煙暴露組和戒煙組巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著均高于正常對(duì)照組 (P均＜0．001)(圖2)。

圖1 小氣道及肺實(shí)質(zhì)HE染色及Masson染色切片 (小氣道× 400，肺實(shí)質(zhì)×100)Fig 1 Small airway and lung parenchyma slices with HE and Masson staining(small airway×400，lung parenchyma×100)

圖2 各組支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類Fig 2 The inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid

肺組織細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，香煙暴露組和戒煙組CXCL9、CXCL10的mRNA表達(dá)水平均顯著增加 (P均＜0．05)，CXCL11mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)，戒煙組CXCL9和CXCL10 mRNA表達(dá)水平顯著高于香煙暴露組(P均＜0．05)(圖3A)。與正常對(duì)照組比較，香煙暴露組MMP2、MMP9、MMP12的mRNA表達(dá)水平顯著升高 (P均＜0．05)，戒煙組MMP9和MMP12的mRNA表達(dá)水平也顯著升高 (P均＜0．05)。香煙暴露組MMP9 mRNA表達(dá)水平顯著高于戒煙組 (P＜0．01)，但MMP12 mRNA表達(dá)水平顯著低于戒煙組 (P＜0．001)(圖3B)。香煙暴露組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組和戒煙組 (P均＜0．01)，戒煙組與正常對(duì)照組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)(圖3C)。

肺組織細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，香煙暴露組和戒煙組的CXCL9、CXCL10、CXCL11蛋白表達(dá)水平均顯著升高 (P均＜0．05)，戒煙組與香煙暴露組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05) (圖 4A)。香煙暴露組和戒煙組的MMP2、MMP9及MMP12蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組 (P均＜0．01)，戒煙組MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著低于香煙暴露組 (P＜0．05)(圖4B)。與正常對(duì)照組比較，香煙暴露組和戒煙TGF-β1均顯著增加 (P均＜0．01)，而兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)(圖4C)。

BALF上清中細(xì)胞因子濃度香煙暴露組和戒煙組的BALF上清中CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-8及TGF-β1濃度均顯著高于正常對(duì)照組 (P均＜0．05)，香煙暴露組IL-6及TNF-α水平顯著高于正常對(duì)照組(P均＜0．05)。戒煙組CXCL10、IL-6及TGF-β1水平均顯著低于香煙暴露組 (P均＜0．01)，CXCL9和CXCL11水平與香煙暴露組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)(圖5)。

圖3 各組肺組織目的基因的mRNA表達(dá)水平Fig 3 The mRNA expressions of target genes in lung tissue

圖4 各組肺組織細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平Fig 4 The protein expressions of cytokines in lung tissue

圖5 各組支氣管肺泡灌洗液上清中的細(xì)胞因子濃度Fig 5 Concentrations of cytokines in bronchoalveolar lavage fluid

討論

本研究觀察到香煙暴露組和戒煙組小鼠BALF、氣道周圍和肺實(shí)質(zhì)中炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯增多、氣道上皮損傷、氣道周圍膠原沉積均較正常組明顯。盡管戒煙組較香煙暴露組有所減輕，但兩者病理學(xué)總評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7，11-12］，即戒煙后COPD患者氣道中仍然存在大量炎癥細(xì)胞。

CXCR3受體是一種炎性趨化因子受體［1-2］，有3種配體，分別是CXCL9、CXCLl0及CXCLl1。CXCR3受體與其配體相結(jié)合后，能夠趨化粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺部聚集［3-4］。本研究結(jié)果顯示，戒煙組和香煙暴露組肺部炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組，同時(shí)CXCR3配體表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，戒煙組CXCL9及CXCL10 mRNA表達(dá)水平高于香煙暴露組。結(jié)合本研究小組此前有關(guān)CXCR3-/-基因敲除小鼠香煙暴露模型的實(shí)驗(yàn)［5-6］，證明了CXCR3及配體在香煙暴露急性肺炎中的作用。本研究戒煙組CXCR3的配體高表達(dá)提示戒煙后肺組織的持續(xù)炎癥可能與CXCR3的配體持續(xù)高表達(dá)相關(guān)。

巨噬細(xì)胞在COPD發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，一方面，巨噬細(xì)胞是MMPs(如MMP1、MMP2、MMP9和MMP12)的重要來(lái)源［13-15］，這些酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞肺實(shí)質(zhì)，導(dǎo)致肺氣腫;另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)MMP9與氣流受限相關(guān)聯(lián)［16］。本研究中戒煙組和香煙暴露組BALF中的巨噬細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增加，同時(shí)MMP2、MMP9和MMP12的蛋白表達(dá)水平亦顯著增加，戒煙組MMP12 mRNA水平甚至顯著高于香煙暴露組。上述結(jié)果表明，戒煙后MMPs水平并未恢復(fù)至正常水平，部分甚至持續(xù)增加，這與巨噬細(xì)胞在肺部持續(xù)存在有關(guān)。戒煙后，上皮細(xì)胞仍高表達(dá)CXCR3的配體，為炎癥細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞在肺部聚集提供動(dòng)力。

TGF-β1是一種多效性細(xì)胞因子，不僅可刺激成纖維細(xì)胞增生和分泌膠原，誘導(dǎo)膠原蛋白產(chǎn)生［17］，還可抑制膠原降解，從而促進(jìn)氣道結(jié)構(gòu)重塑，而氣道結(jié)構(gòu)重塑被認(rèn)為是COPD氣流受限不可逆的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［18］。吸煙的COPD患者肺組織中的TGF-β1表達(dá)明顯高于健康者［19］。本研究結(jié)果顯示，香煙暴露組小鼠肺組織中TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)水均明顯高于其他兩組;盡管戒煙組較香煙暴露組降低，但蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組。目前尚不明確TGF-β1與CXCR3配體之間的聯(lián)系。但MMPs可以激活TGF-β1［20］，因此TGF-β1的表達(dá)增強(qiáng)可能是由于CXCR3的配體趨化炎癥細(xì)胞至氣道及肺實(shí)質(zhì)并產(chǎn)生MMPs，間接促進(jìn)TGF-β1表達(dá)。

IL-6是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生。上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞在某些刺激下亦可產(chǎn)生IL-6［21］。研究表明哮喘患者的BALF及痰液中IL-6水平明顯升高［22-23］，IL-6在哮喘氣道高反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。有報(bào)道稱高達(dá)2/3的COPD患者隨著時(shí)間推移會(huì)出現(xiàn)氣道高反應(yīng)［24］，吸煙人群氣道高反應(yīng)發(fā)病率約20%。本研究中香煙暴露組IL-6較正常組明顯升高，筆者推測(cè)香煙暴露中氣道高反應(yīng)的出現(xiàn)可能也與IL-6相關(guān)。戒煙組IL-6明顯低于香煙暴露組，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明戒煙后氣道高反應(yīng)可以得到緩解，與臨床上觀察到戒煙患者氣道高反應(yīng)減輕相一致［25］。

IL-8亦稱為CXCL8，是屬于趨化因子家族的細(xì)胞因子，可由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生［26］，還可在促炎因子 (如IL-1、TNF-α)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生［27］。IL-8在氣道炎癥中發(fā)揮著重要作用。本研究中，香煙暴露組及戒煙組BALF上清中的IL-8濃度明顯高于正常對(duì)照組;香煙暴露組的TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組，戒煙組的TNF-α也高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α水平的差異可能解釋暴露組中IL-8水平升高的的結(jié)果。

綜上，香煙暴露引起炎癥細(xì)胞在肺組織中聚集，戒煙后氣道及肺實(shí)質(zhì)中的炎癥細(xì)胞仍較明顯，戒煙后小鼠中CXCL9、CXCL10及CXCL11等CXCR3配體水平仍較高，結(jié)合此前CXCR3-/-基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)可能是戒煙后高表達(dá)CXCR3配體，趨化炎癥細(xì)胞聚集于肺組織，炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，如MMPs、IL-8、TGF-β1及TNF-α等，從而引起肺損傷及氣道重塑。由于本研究小鼠模型的香煙暴露及戒煙時(shí)間較短，與長(zhǎng)期吸煙或戒煙的實(shí)際情況可能存在差異，這是本研究的不足之處，因此需進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

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Differential Expression of the Inflammation-associated Chemokines/cytokines in Mouse Lung after Exposure to Cigarette Smoke and Smoking Cessation

LI Jiu-rong1，ZHOU Wei-xun2，ZHAO Zhao-xia3，GAO Jin-ming1

1Department of Respiratory Diseases，2Department of Pathology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China3Department of Clinical Laboratory，the Fifth Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang 050021，China

GAO Jin-ming Tel：010-69155028，E-mail：gjinming@yahoo．com

Objective To determine the changes in the airway inflammation-related cytokine/chemokine profiles after exposure to cigarette smoke(CS)and smoking cessation(SC)．Methods A total of 18 male C57BL/6 mice were equally divided into three groups：CS group，SC group，and normal control group．The airway resistance，lung morphology，and collagen deposition around airways were determined．HE staining and Masson trichrome staining were used for histopathological analysis．The inflammatory cells in bronchoalveolar lav-age fluid(BALF)were assessed．The inflammation-associated cytokines were determined using real-time PCR and immunohistochemistry．Expressions of CXCR3 ligands including the CXCL9，CXCL10，CXCL11 and other cytokines in lung tissue and BALF were also analyzed．Results The airway resistance significantly increased in both CS group and SC group when compared with the normal control group．Lung pathological scores in both CS group and SC group were also higher than that in the normal control group，while there was no significant difference between the CS group and SC group．Inflammatory cells including the neutrophils，macrophages，and lymphocytes also increased in both the CS group and SC group at both mRNA and protein levels．The mRNA levels of CXCL9，CXCL10，MMP9，and MMP12 were significantly higher in CS group and SC group than those in the normal control group(all P＜0．05)．The protein expression levels of CXCL9，CXCL10，CXCL11，MMP2，MMP9，MMP12，and TGF-β1 were significantly higher in CS group and SC group than those in the normal control group(all P＜0．05)．Compared with the normal control group，the concentrations of CXCL9，CXCL10，CXCL11，IL-8，and TGF-β1 in the BALF supernatants of the CS group and SC group significantly increased (P＜0．05);in addition，the IL-6 and TNF-α concentrations also increased in the CS group(both P＜0．05)．Conclusions CS exposure triggers inflammatory cell flux and accumulation in the lung parenchyma and BALF．As a consequence，the inflammatory cytokines increase dramatically．After CS，the cytokines/chemokines can decrease，but is still higher than in non-smokers．

CXCR3 ligands;cigarette smoke;smoking cessation;pulmonary inflammation Acta Acad Med Sin，2014，36(3)：241-248

高金明 電話：010-69155028，電子郵箱：gjinming@yahoo．com

R392．3

A

1000-503X(2014)03-0241-08

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．03．003

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81170040)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81170040)

2014-02-12)

·論 著·