吉非替尼對不同腫瘤患者m iR-21、m iR-155的表達和PI3K/Akt通路的影響

朱劍梅,金科

(四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院城東病區(qū),血液腫瘤科,四川 成都 610110)

吉非替尼對不同腫瘤患者m iR-21、m iR-155的表達和PI3K/Akt通路的影響

朱劍梅,金科

(四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院城東病區(qū),血液腫瘤科,四川 成都 610110)

目的 探討3組不同腫瘤患者血漿中miR-21、miR-155及組織中p-PI3K、p-Akt的表達及吉非替尼干預(yù)的影響。方法選取2011年3月～2014年2月在四川省人民醫(yī)院血液腫瘤科收治的腫瘤患者75例，經(jīng)病理確診為食道癌28例（A組)，胃癌25例（B組)，非小細胞肺癌22例（C組)，另選取56例無腫瘤人員作為對照組（分為D1、D2、D3組)。采用RT-PCR和Western blot檢測吉非替尼干預(yù)前后患者血清及組織中miR-21、miR-155、p-PI3K、p-Akt的表達情況。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示:與對照組相比，胃癌及非小細胞肺癌患者血漿中miR-21、miR-155表達明顯升高（P＜0.01)，食道癌患者血漿miR-155表達明顯升高（P＜0.01)，但miR-21表達無差異；采用吉非替尼干預(yù)后，胃癌及非小細胞肺癌患者血漿中miR-21、miR-155表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，食道癌患者血漿中miR-155明顯升高（P＜0.05)，miR-21表達無明顯變化。Western blot結(jié)果顯示:食道癌及胃癌患者組織中p-Akt的表達量明顯高于對照組（P＜0.01)，但非小細胞肺癌患者組織中p-Akt的表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義；胃癌、非小細胞肺癌患者組織中p-PI3K的表達量明顯高于對照組（P＜0.05，P＜0.01)，但食道癌患者組織中p-PI3K的表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 miR-21、miR-155在3種不同腫瘤患者血漿中均呈高表達，吉非替尼干預(yù)后，能明顯降低3種癌癥細胞患者血漿中miR-21、miR-155 的表達。

miR-21；miR-155；吉非替尼；PI3K/Akt通路；胃癌；食道癌；非小細胞肺癌

微小RNA(microRNA)是一類非編碼RNA,長度約為18～25個核苷酸,在RNA的降解以及蛋白抑制方面有著非常重要的作用,microRNA存在于大多數(shù)真核生物細胞中,參與細胞的分化、增殖以及凋亡等過程,目前作為腫瘤標志物而被廣泛研究。多項研究顯示microRNA對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著非常重要的作用［1-3］。近年來,食道癌、胃癌及非小細胞肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率均有所升高,胃癌的死亡率排在第四位。研究證實microRNA可以在外周血中穩(wěn)定存在［4］。近年來使用抗腫瘤藥物后產(chǎn)生的耐藥性是研究的焦點,其中miR-21、miR-155也參與了抗腫瘤藥物的耐藥性［5-6］。目前,研究顯示microRNA可以通過PI3K/Akt信號通路影響癌癥細胞的侵襲,蛋白質(zhì)的合成以及細胞周期等等,microRNA與Akt信號通路構(gòu)成一個AktmicroRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同完成調(diào)控細胞的生長,國內(nèi)外學者證實miR-126、miR-451以及miR-145等微小RNA都與PI3K/Akt通路有關(guān)［7-9］,但是腫瘤患者在使用抗腫瘤藥物初期體內(nèi)miR-21、miR-155表達如何鮮見報道,此外使用抗腫瘤藥物后對microRNA介導(dǎo)的下游通路影響如何,報道也較少,本研究旨在探討抗腫瘤藥物對腫瘤患者體內(nèi)miR-21、miR-155的影響,進而探討抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的原因,為臨床解決抗腫瘤藥物耐藥性提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年3月～2014年2月四川省人民醫(yī)院血液腫瘤科收治的腫瘤患者75例,經(jīng)病理確診為食道癌28例(A組),其中男性患者16例、女性12例,平均年齡為(58.6±6.8)歲;胃癌25例(B組),其中男性患者13例、女性12例,平均年齡為(62.7±6.5)歲;非小細胞肺癌22例(C組),其中男性患者10例、女性12,平均年齡為(65.6±7.1)歲。另再選取56例無腫瘤人員作為對照組,其中18例因胃部疾病需要切除部分組織(D1組)、20例因肺部疾病需要切除部分組織(D2組)、18例為食道疾病患者(D3組)且切除部分食道組織。本實驗所有患者在入選時均簽訂知情同意書,并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。各組患者在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 主要試劑及儀器 RNA提取物試劑盒購于美國ABI公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國LC Science公司;實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物有限公司,抗體鼠抗人p-Akt、Akt購于 Bioworlde公司,PI3K以及 p-PI3K均購于 Santa Cruz公司。

7902HT熒光定量PCR儀購于美國ABI公司,-80℃超低溫冰箱購于美國Beckman公司,蛋白定量酶標儀及垂直電泳儀購于美國BioRad公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集:75例癌癥患者均經(jīng)癌癥切除手術(shù)后采用TP方案治療4周期:第一天靜脈滴注多西他賽75mg/m2,第一天～第三天靜脈滴注順鉑25mg/m2,每個周期持續(xù)21 d;同時每天給予吉非替尼(英國阿斯利康公司)250 mg口服。取所有手術(shù)患者術(shù)后新鮮組織,并迅速置于液氮中,在-80℃中保存?zhèn)溆谩Ｋ袑嶒灮颊咴赥P方案治療前1天早晨及治療4周后在體檢中心于肘靜脈采血5 mL,置于真空EDTA-K2抗凝管中,1000 r/min離心獲取血小板豐富的血漿,接著以1800 r/min離心7min從而獲取血小板貧瘠血漿。3組不同腫瘤患者按照藥物干預(yù)前后將血漿分為:藥物干預(yù)前為A1、B1、C1;藥物干預(yù)后為A2、B2、C2,對照組采用的是2次取血的均值,用D1、D2、D3表示。

1.3.2 血漿RNA提取:取各組患者500μL血小板貧瘠血漿,置于1.5mL EP管中,加入20μL的Proteinase K進行消化,按照Trizol LS試劑盒說明書進行后續(xù)操作,使用NanoDrop 1000檢測血漿中總RNA的純度,當比值在1.8～2.0之間時表明純度較好。

1.3.3 RT-PCRP:配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:無RNA酶雙蒸水14.75μL,0.5μLRNase抑制劑,1μL逆轉(zhuǎn)錄酶。將100 ng總RNA、2μL RT引物以及5μL Buffer加入到上述反應(yīng)體系中,43℃50min,95℃,5min進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上游引物以及下游引物各1μL、12.5μL 2×Master Mix,補充雙蒸水至25μL。95℃預(yù)變性5min,95℃變性25 s,50℃退火30 s,70℃延伸40 s,35個循環(huán),72℃后延伸5min。RT引物以及PCR引物,其中miR-21基因正向引物5'-TAGCTTATCAGACTGATG-3',反向引物為5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3';miR-155基因正向引物5'-CAAGTTTTGTTGGTTGGTTT-3',反向引物為 5'-GGCAAGGCATTATGTGATAC-3';U6的正向引物5'-CGTGCAGAGGCCATCGCAGAAGACAT-3',反向引物為5'-CACTTCTCAACCAAAATTCTTCAAAG-3',購于廣州銳博生物有限公司。記錄各個反應(yīng)管中的熒光信號所設(shè)立的閾值時循環(huán)數(shù)(CT值),將原始數(shù)據(jù)取3次以上重復(fù)掃描后取平均值,以U6作為內(nèi)參進行歸一,計算 miR-21、miR-155相對表達情況。

1.3.4 Western blot:取各實驗組患者組織100 mg,直接加入200μL細胞裂解液及15μL PMSF進行勻漿,將勻漿后的液體置于冰上裂解30 m in,4℃下以12000 r/m in離心30 min,去上清,經(jīng)考馬斯亮藍法經(jīng)行定量。蛋白質(zhì)樣品同1/4倍量5×SDS上樣緩沖液混合均勻,熱水煮沸7～8 min,在10%SDS-PAGE 115 V進行電泳,200 mA恒流2 h,濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上,再以5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉3 h,加一抗(即抗體鼠抗人 p-Akt、Akt以及 PI3K以及 p-PI3K,按照1∶500進行稀釋)。TBST洗膜3次,每次10min,然后與結(jié)合有辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(1∶4000稀釋)室溫孵育1 h,TBS洗膜3次,每次10min,與化學發(fā)光劑ECL反應(yīng),X線膠片曝光顯影。組織中 p-Akt、Akt以及 PI3K以及p-PI3K蛋白含量的測定采用的是灰度值掃描,通過與β-actin進行比較得出灰度值比。

1.4 統(tǒng)計學方法 分別采用SPSS17.0及ImageJ 4.2對數(shù)據(jù)及圖片進行分析處理。正態(tài)計量資料用“±s”表示,組間比較采用t檢驗;組間對比采用方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 吉非替尼干預(yù)前各組患者血漿中miR-21、miR-155表達比較 RT-PCR結(jié)果表明:吉非替尼干預(yù)前,胃癌(B1)以及非小細胞肺癌患者(C1)組織中 miR-21、miR-155表達較對照組(D2,D3)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);食道癌組患者(A1)miR-155表達較對照組(D1)明顯升高(P＜0.01),miR-21表達相對于對照組差異無統(tǒng)計學意義(見圖1)。

圖1 吉非替尼干預(yù)前各組患者血漿miR-21、miR-155表達比較Fig.1 Comparison ofmiR-21,miR-155 expression in each group before gefitinib intervention

2.2 吉非替尼干預(yù)后各組患者血漿miR-21、miR-155表達比較 吉非替尼藥物干預(yù)后,胃癌及非小細胞肺癌患者血漿中miR-21、miR-155表達與干預(yù)前相比均有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但食道癌組患者血漿中miR-155與干預(yù)前相比明顯升高(P＜0.05),miR-21表達無明顯變化(見圖2)。

圖2 吉非替尼干預(yù)后各組患者血漿miR-21、miR-155表達比較Fig.2 Comparison ofmiR-21,miR-155 expression in each group after gefitinib intervention

2.3 各組患者組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較 Western blot結(jié)果顯示:與對照組相比,食道癌(A1)及胃癌(B1)患者組織中p-Akt呈高表達(P＜0.01),非小細胞肺癌(C1)患者組織中p-Akt無明顯差異;胃癌、非小細胞肺癌患者組織中p-PI3K呈高表達(P＜0.05,P＜0.01),食道癌患者組織中p-PI3K無明顯差異(見圖3)。

圖3 各組患者組織p-PI3K、p-Akt表達比較Fig.3 Comparison of p-PI3K,p-Akt expression in each group of patient organizations

3 討論

微小RNA參與調(diào)控細胞周期以及分化等基本生理功能,目前的研究證實該類小分子并不由血細胞產(chǎn)生,且其在外周血中不受酸性、堿性甚至高溫的影響［10］。通過RNA分子表達譜發(fā)現(xiàn),miR-21、miR-155是目前在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中被研究的較為成熟的小分子RNA。研究證實這2種小分子RNA在腫瘤患者血清中表達異常增高［11］,而隨著miR-21、miR-155表達的增高,患者癌癥組織周圍血管新生也較為明顯［12］。有研究顯示,高表達miR-21、miR-155可以不同程度的增加患者組織或者血清中血管內(nèi)皮生長因子以及堿性成纖維生長因子的含量,而促進這一作用的可能途徑有ERK或者PI3K/Akt信號途徑［13-15］。本研究通過采集癌癥患者手術(shù)后新鮮組織進行western blot檢測,發(fā)現(xiàn)在miR-21及miR-155高表達的同時,患者組織中p-PI3K、p-Akt等蛋白表達也異常增加。PI3K是Akt上游信號分子,其強表達可以刺激p-Akt,但在本研究中非小細胞肺癌患者p-PI3K、p-Akt蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,可能是樣本量小的緣故。

近幾年來本院就診胃腸疾病的患者同既往相比多了近3倍左右,而胃癌以及食道癌患者多了近1倍左右［16］。根據(jù)相關(guān)部門的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),每年全球?qū)⒔?0萬人死于食道癌,而肺癌已是全球死亡率最高的疾?。?7-19］。本研究結(jié)果顯示,胃癌患者相對于食道癌以及非小細胞肺癌患者血漿中miR-21、miR-155的表達略微要高一些,此外胃癌患者組織中血管新生因子表達也強于食道癌和非小細胞肺癌患者。

試驗中有出現(xiàn)與預(yù)期較為較為相反的結(jié)果。非小細胞肺癌是3種腫瘤當中發(fā)病最為兇險的,但是miR-21、miR-155表達卻在3者之中不算最高。且經(jīng)過吉非替尼治療后短期內(nèi)其表達出現(xiàn)下降的趨勢。本研究沒有驗證藥物干預(yù)后患者體內(nèi)p-PI3K、p-Akt等蛋白表達情況,主要原因是不能很好獲得同一患者的組織。后期預(yù)從血漿中分離單核細胞或者泡沫細胞進行檢測。

以往研究并未探討微小RNA在癌癥組織的表達,以及其對于癌癥患者體內(nèi)其他相關(guān)因子的影響。有學者研究抗腫瘤藥物的耐藥性與微小RNA的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)某些抗腫瘤藥物的耐藥性與某些微小RNA的高表達相關(guān)［15］,而體外采用微小RNA抑制劑后,腫瘤增殖能力下降或者某些蛋白表達有所改善。較少有學者研究抗腫瘤藥物是不是對所有微小RNA均無作用,還是使用到一定階段后才產(chǎn)生的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn):吉非替尼可以抑制胃癌以及非小細胞肺癌患者血漿中miR-21、miR-155,而對食道癌中的作用較小,這一結(jié)果一定程度上反映了抗腫瘤藥物出現(xiàn)的耐藥性與miR-21、miR-155高表達是在使用之后出現(xiàn)的。值得提出的是,后期尚需要做隨訪及時檢測miR-21、miR-155與患者生存率的相關(guān)性,以及抗腫瘤藥物在什么時間段出現(xiàn)的耐藥性以及此時miR-21、miR-155的表達情況。

綜上所述,miR-21、miR-155在3種不同腫瘤患者血漿均呈明顯的升高趨勢,吉非替尼干預(yù)后3種癌癥患者血漿中miR-21、miR-155均有不同程度的降低。

［1］ lorio MV，Croce CM.MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics，monitoring and therapeutics.A comprehensive review［J］.EMBO Mol Med，2012，4（3):143-159.

［2］ Lee JH，Voortman J，Dingemans AM，et al.MicroRNA expression and clinical outcome of small cell lung cancer［J］.PLOSONE，2011，6（6):e21300.

［3］ Flynt AS， Lai EC.Biological principles of microRNA-mediated regulation:shared themes amid diversity［J］.Nat Rev Genet，2008，9（11):831-842.

［4］ Bal H，Xu R，Cao Z，et al.Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562 cell line［J］.FEBS Lett，2011，585（2):402-408.

［5］ Li X，Zhang Y，Ding J，et al.Survival prediction of gastric cancer by a seven-microRNA signature［J］.Gut，2010，59（5):579-585.

［6］ 秦安東，周涯，盛美霞，等.MicroRNA-155對人肺癌95D細胞生長的影響［J］.中國肺癌雜志，2011，14（7):575-580.

［7］ Rao E，Jiang C，Ji M，et al.The miRNA-17 ～92 cluster mediates chemoresistance and enhances tumor growth inmantle cell lymphoma via PI3K/AKT pathway activation ［J］.Leukemia，2012，26 （5):1064-1072.

［8］ Tian Y，Nan Y，Han L，et al.MicroRNA miR-451 downregulates the PI3K/AKT pathway through CAB39 in human glioma［J］.Int JOncol，2012，40（4):1105-1112.

［9］ Noguchi S，Yasui Y， Iwasaki J， et al.Replacement treatment with microRNA-143 and-145 induces synergistic inhibition of the growth of human bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt and MAPK signaling pathways［J］.Cancer Lett，2013，328（2):353-361.

［10］ Tsukamoto Y， Nakada C， Noguchi T， et al.MicroRNA-375 is downregulated in gastric carcinomas and regulates cell survival by targeting PDK1 and 14-3-3zeta［J］.Cancer Res，2010，70 （6):2339-2349.

［11］ Greither T，Grochola LF，Udelnow A，et al.Elevated expression of microRNAs155，203，210 and 222 in pancreatic tumors is associated with poorer survival［J］.Int JCancer，2010，126（1):73-80.

［12］ Jiang S，Zhang HW，Lu MH，et al.MicroRNA-155 functions as an OncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling 1 gene［J］.Cancer Res，2010，70（8):3119-3127.

［13］ Zheng SR，Guo GL，Zhang W，et al.Clinical significance of miR-155 expression in breast cancer and effects ofmiR-155 ASO on cell viability and apoptosis［J］.Oncol Rep，2012，27（4):1149-1155.

［14］ Jiang S，Zhang HW，Lu MH，et al.MicroRNA-155 functions as an OncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling 1 gene［J］.Cancer Res，2010，70（8):3119-3127.

［15］ 葛甜甜，梁勇，付蓉，等.淋巴瘤患者血漿中 miR-21、miR-155、miR-210的表達及臨床意義［J］.中國實驗血液學雜志，2012，20（2):305-309.

［16］徐登誠，劉寶瑞，沈潔.胃癌組織和循環(huán)miR-21與胃癌伊立替康敏感性關(guān)系的初步研究［J］.中國癌癥雜志，2013，23（9):744-750.

［17］楊曉輝，葛箭，蔡慧珍，等.回族人群飲食習慣與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學，2012，39（11):2674-2677.

［18］ Tsujiura M，Ichikawa D，Komatsu S，et al.Circulating microRNAs in plasma of patientswith gastric cancers［J］.Br JCancer，2010，102（7):1174-1179.

［19］ Huang Z，Huang D，Ni S，et al.PlasmamicroRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer［J］.Int J Cancer，2010，127（1):118-126.

(編校:吳茜)

Effect of gefitinib on m iR-21,m iR-155 expression and PI3K/Akt pathway in patients w ith three different tumor

ZHU Jian-mei,JIN Ke

(Department of Hematology and Oncology,East Department of Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincal People'Hospital,Chengdu 610110,China)

Objective To investigate themiR-21,miR-155 in three different tumor patients plasma and the expression of p-PI3K、p-Akt in tissue,then to study the intervention by gefitinib.Methods 75 cases patientswith cancerwere selected and treated in the Sichuan Provincial People's Hospital from March 2011 to February 2014,28 cases ofesophagus cancer(A group),25 cases ofgastric carcinoma(group B),22 cases of nonsmall-cell lung cancer(C group),the other 56 cases as control group(no tumor personnel divided into D1 D2,3,D group),the serum and tissue of patients with Western blot and RT-PCR detection in p-PI3K,p-Akt and miR-21,miR-155 expression,and the results were statistically analyzed.Results Western blot results showed that:the expression of p-Akt in esophageal and gastric carcinoma patients was significantly higher,the difference was statistically significant(P＜0.01),while expression of p-Akt of non-small cell lung cancer tissue compared with control group was no significant difference;expression of p-PI3K in gastric cancer,non-small cell lung cancer tissuewas higher,the difference was statistically significant(P＜0.05,P＜0.01);tissue expression levels of p-PI3K in patients with esophageal cancer were compared with the control group,and the difference was not statistically significant.Compared with the control group,miR-21,miR-155 expression in plasma of gastric cancer and non-small cell lung cancer were higher,the difference was statistically significant(P＜0.01),plasma miR-155 expression in patients with esophageal cancer were higher than control group(P＜0.01),but no differences in the expression ofmiR-21;after using gefitinib to intervene,miR-21,miR-155 expression in plasma of gastric cancer and non-small cell lung cancer was significantly decreased,and the difference was statistically significant(P＜0.05),plasma miR-155 in patients with esophageal cancer was significantly higher(P＜0.05),miR-21 expression did not change.Conclusion miR-21,miR-155 are highly expressed in three different patientswith cancer,while gefitinib after intervention for patientswith gastric cancer and non-small cell lung cancer effect is better,but for the intervention of esophagus cancer patientswith somewhat less effect.

miR-21;miR-155;gefitinib;gastric cancer;esophagus cancer;nonsmall-cell lung cancer

朱劍梅，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的化療及姑息治療，E-mail：zhujianmei@2008.sina.com。

R733.1

A

1005-1678（2014)06-0153-05