川芎嗪對(duì)激素性股骨頭缺血壞死模型兔血管新生因子的影響及促成骨作用的研究

李寶林,胡勇

(海南省農(nóng)墾那大醫(yī)院 骨科,海南 儋州 571700)

川芎嗪對(duì)激素性股骨頭缺血壞死模型兔血管新生因子的影響及促成骨作用的研究

李寶林,胡勇

(海南省農(nóng)墾那大醫(yī)院 骨科,海南 儋州 571700)

目的 探討川芎嗪對(duì)激素性股骨頭缺血壞死模型兔血管新生因子的影響及其促成骨作用。方法 選取28只健康新西蘭大白兔，雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.6)kg，隨機(jī)分成A、B 2組。A組10只，每周肌注2次生理鹽水，為對(duì)照組；B組18只，每周肌注2次8mg/kg地塞米松磷酸鈉造模，為模型組。連續(xù)處理4周后，隨機(jī)選取對(duì)照組和模型組各2只大白兔，行影像檢查并做病理組織切片。證實(shí)造模成功后，將B組隨機(jī)分成模型組和治療組，每組8只。治療組給予耳緣靜脈注射14mg/kg鹽酸川芎嗪注射液，模型組給予1.5mL生理鹽水。實(shí)驗(yàn)8周后處死動(dòng)物，采用Western blot法檢測(cè)旋股內(nèi)側(cè)動(dòng)脈和股靜脈血管VEGF的表達(dá)，數(shù)字減影血管造影法檢測(cè)股骨頭血管數(shù)目及高倍顯微鏡下計(jì)算空骨陷窩比列。結(jié)果 治療組旋股動(dòng)脈和股靜脈血管VEGF表達(dá)量較模型組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；治療組股骨頭血管數(shù)目較模型組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；空骨陷窩比例，治療組較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。結(jié)論 川芎嗪能上調(diào)激素性股骨頭壞死模型兔的血管新生因子表達(dá)，且對(duì)股骨頭的重生具有促進(jìn)作用。

川芎嗪；血管新生因子；股骨頭壞死

股骨頭缺血性壞死亦稱股骨頭無(wú)菌性壞死和股骨頭壞死(Osteonecrosis of femoral head,ONFH),是指股骨頭內(nèi)細(xì)胞因供血不足而死亡引起的骨骼疾?。?］。多種非創(chuàng)傷性因素可造成ONFH,包括肥胖、高血壓、酒精中毒和過(guò)多使用糖皮質(zhì)激素等［2-3］。長(zhǎng)期激素治療是常見(jiàn)股骨頭壞死的主要原因,但確切的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。川芎嗪來(lái)源于傘形科植物藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根,是一種生物堿。研究報(bào)道顯示:川芎嗪能夠改善急性腦出血、急性腦梗死、改善微循環(huán)、抗血栓等［4-8］。本文通過(guò)構(gòu)建兔激素性股骨頭缺血壞死模型,采用鹽酸川芎嗪進(jìn)行治療,旨在探討川芎嗪對(duì)激素性股骨頭缺血壞死血管新生因子的影響及其促成骨作用,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、主要試劑與儀器 鹽酸川芎嗪注射液(山西康意制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20057322);地塞米松磷酸鈉(天津金耀氨基酸有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H12020515);抗體如兔抗VEGF、鼠抗 β-actin均購(gòu)于 Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA),VEGF(MAB-243)SP免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新公司)。主要儀器有CM2000C型病理圖像分析儀［北大悅維佳(北京)科技有限公司］,光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取28只健康新西蘭大白兔,雌雄各半,體質(zhì)量(2.5±0.6)kg,隨機(jī)分成A、B 2組,A組10只,每周肌注2次生理鹽水,為對(duì)照組;B組18只,每周肌注2次8mg/kg地塞米松磷酸鈉造模。連續(xù)處理4周后,隨機(jī)選取A、B 2組各2只大白兔做影像檢查并做病理組織切片。證實(shí)造模成功后,將B組隨機(jī)分成模型組和治療組,每組8只。治療組每天清晨耳緣靜脈注射14mg/kg鹽酸川芎嗪注射液1次,對(duì)照組和模型組每天清晨耳緣靜脈注射1.5mL生理鹽水1次,共注射8周。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Western blot檢測(cè)VEGF表達(dá):動(dòng)物治療4周后,處死。根據(jù)錢德慧［9］相關(guān)方法提取旋股動(dòng)脈和股靜脈血管細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整蛋白濃度,采用15%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳,隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上。用含5%脫脂奶粉的封閉緩沖液封閉3h。室溫下與一抗(1∶1000)結(jié)合2 h,PBS清洗后與二抗結(jié)合2 h,ECL發(fā)光試劑于暗室內(nèi)曝光顯影。

1.3.2 數(shù)字減影血管造影觀察血管數(shù):采用5%水合氯醛溶液2mL/kg麻醉新西蘭大白兔,切開(kāi)局部,使股動(dòng)脈顯現(xiàn),20號(hào)針頭穿刺成功后,采用 Hicor數(shù)字減影系統(tǒng),用碘普羅胺10mL,注入速度為1mL/s,并以15張/秒的速度采片。股骨頭至大粗隆下緣之間區(qū)域?yàn)锳區(qū),粗隆下緣以下區(qū)域?yàn)锽區(qū),觀察并計(jì)數(shù)股骨頭供血血管數(shù)。

1.3.3 顯微鏡下觀察空骨陷窩:動(dòng)物處死后,于無(wú)菌條件下取出新西蘭大白兔兩側(cè)股骨頭,10%福爾馬林緩沖液固定24 h,用15%的EDTA脫鈣液加微波輻射進(jìn)行脫鈣,流水沖洗,70%乙醇脫水,石蠟包埋,切成約5μm后的切片,在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域,觀察計(jì)數(shù)50個(gè)骨陷窩,并找出空骨陷窩數(shù),計(jì)算空骨陷窩率,取3個(gè)區(qū)域的平均值?？展窍莞C率=空骨陷窩數(shù)/50×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示,組間比較采用t檢驗(yàn);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VEGF表達(dá)結(jié)果比較 Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,模型組VEGF表達(dá)量顯著降低(P＜0.01);與模型組相比,治療組VEGF表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見(jiàn)圖 1)。

圖1 各組VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.1 Results of VEGF expression in each group

2.2 各組血管數(shù)觀察結(jié)果比較 數(shù)字減影血管造影結(jié)果顯示:模型組A、B 2區(qū)血管數(shù)較對(duì)照組減少,差異有顯著性。治療組A區(qū)較模型組有所增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,B區(qū)血管數(shù)較模型組增加明顯,差異具有顯著性(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組分區(qū)血管數(shù)**P＜0.01,與對(duì)照組比較;#P＜0.05,##P＜0.01,與模型組比較Fig.2 The number of blood vessels in each group**P＜0.01,compared with control group;#P＜0.05,##P＜0.01,compared with model group

2.3 各組空骨陷窩率結(jié)果比較 顯微鏡下觀察各組空骨陷窩:與正常組相比,模型組空骨陷窩率顯著增加(P＜0.01),治療4周后,與模型組相比,治療組空骨陷窩率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見(jiàn)表1)。

3 討論

股骨頭壞死是一種常見(jiàn)的骨科疾病,多發(fā)生在中年,嚴(yán)重影響患者正常生活。長(zhǎng)期大量使用糖皮質(zhì)激素是股骨頭壞死的常見(jiàn)誘因之一［10］。糖皮質(zhì)激素是一種強(qiáng)血管生成抑制劑,能通過(guò)多種方式破壞血液循環(huán),導(dǎo)致局部血液灌流,并能打斷股骨頭骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡,抑制其再生,加速其裂解,最終導(dǎo)致局部缺血引起骨細(xì)胞凋亡,其還能抑制壞死骨組織的修復(fù)和重建,進(jìn)一步加劇骨壞死。

目前對(duì)股骨頭壞死的治療效果均不理想,有報(bào)道顯示抗血小板聚集藥物有望用于該疾病的治療［11］。近年來(lái)對(duì)川芎嗪的研究發(fā)現(xiàn),其具有急性腦出血、急性腦梗死、改善微循環(huán)、抗血栓等作用［5-8］,而川芎嗪用于激素性股骨頭缺血壞死的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

構(gòu)建激素性股骨頭壞死模型,多選取兔為模式動(dòng)物［4,11-13］。本文選用新西蘭大白兔,通過(guò)注射地塞米松鈉肌構(gòu)建激素性股骨頭壞死模型,再予以鹽酸川芎嗪治療。結(jié)果顯示:鹽酸川芎嗪能夠促進(jìn)激素性股骨頭壞死模型兔中血管新生因子VEGF的表達(dá),增加股骨頭供血血管數(shù),降低空骨陷窩率。表明川芎嗪對(duì)激素性股骨頭缺血壞死兔模型有一定的改善作用,是潛在的治療激素性股骨頭壞死的藥物。

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(編校:吳茜)

Effects of tetramethylpyrazine on the angiogenesis and osteogenesis of steroid-induced osteonecrosis in rabbits

LIBao-lin,HU Yong

(Department of orthopedics,Hainan Nongken Nada hospital,Danzhou 571700,China)

Objective To investigate the effect of tetramethylpyrazine on the angiogenic factor and osteogenesis of steroid-induced osteonecrosis in rabbits.Methods New Zealand white rabbitswere divided into normal control group,model group and treatment group.The animalswere sacrificed after 8 weeks experiment,Western blotassay to detect the expression of VEGF in femoral artery and femoral vein,digital subtraction angiography to detect the number of femoral vessels and high-powered microscope to detect rate of empty lacunae.Results The expression of VEGF in femoral artery and femoral vein was higher thanmodelgroup and the differencewas significant(P＜0.01);the number of femoral vascular on treatmentgroup wasmore thanmodel group and the differencewas statistically significant;the rate of empty lacunae on treatmentgroup was lower thanmodel group with statistical significance(P＜0.01).Conclusion Tetramethylpyrazine could unregulate the expression of angiogenic factor in rabbitmodel of steroid-induced osteonecrosis,and the rebirth of the femoral head is facilitated.

tetramethylpyrazine;angiogenic factors;osteonecrosis

R274

A

1005-1678（2014)06-0069-03

李寶林，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：骨科臨床，E-mail：linbaolin852@126.com。