吡咯喹啉醌對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)機(jī)制的研究

王來芳,丁艷杰,趙清Δ,陳麗娟

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,河南 開封 475000;2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部,江蘇 南京 210029)

吡咯喹啉醌對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)機(jī)制的研究

王來芳1,丁艷杰1,趙清1Δ,陳麗娟2

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,河南 開封 475000;2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部,江蘇 南京 210029)

目的 研究吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)機(jī)制。方法 6月齡日本大耳白兔36只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及偽手術(shù)組（每組12只)。觀察軟骨大體形態(tài)并行軟骨Pelletier JP評(píng)分；制備切片行HE染色，光鏡下觀察HE切片并按照Mankin評(píng)分表對(duì)其評(píng)分；行II型膠原免疫組化染色，光鏡下觀察II型膠原表達(dá)情況；行軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL法)，在光鏡下觀察軟骨細(xì)胞凋亡情況；通過透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞線粒體形態(tài)和數(shù)目的改變。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Kellgren-Lawrance評(píng)分差異有顯著性（P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組電鏡下軟骨細(xì)胞線粒體數(shù)多于對(duì)照組。結(jié)論 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PQQ可保護(hù)軟骨細(xì)胞，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)及功能的破壞，促進(jìn)軟骨的代謝和自身修復(fù)，防止關(guān)節(jié)軟骨退變。吡咯喹啉醌可能是通過保護(hù)軟骨細(xì)胞線粒體而發(fā)揮作用的。

骨關(guān)節(jié)炎；吡咯喹啉醌；軟骨細(xì)胞

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種多見于老齡人的常見慢性疾病,我國(guó)50歲以上人口OA發(fā)病率逐年升高,國(guó)外60歲以上發(fā)病率高達(dá)78%。伴隨社會(huì)人口老齡化進(jìn)程的加速,OA發(fā)病人數(shù)將日益增多,越來越多的人將飽受OA的困擾。OA將成為降低老年人生活質(zhì)量的主要原因之一,現(xiàn)已引起社會(huì)和醫(yī)學(xué)界的高度重視。OA的特征性病理變化是關(guān)節(jié)軟骨的破壞,其本質(zhì)是關(guān)節(jié)軟骨的生成與骨的破壞和修復(fù)相互交替的復(fù)雜過程。吡咯喹啉醌最先被 Hauge等［1］發(fā)現(xiàn),它是 Salisbury和 Duine［2-3］從甲基營(yíng)養(yǎng)菌體內(nèi)的甲醇脫氫酶中提取獲得的。在動(dòng)植物和人體內(nèi)都含有一定量的PQQ［4-6］,對(duì)動(dòng)植物的生存起重要作用。PQQ作為電子的供體和受體參與氧化還原反應(yīng)過程,它可以催化連續(xù)的氧化還原過程,在許多生物體的氧化還原反應(yīng)起重要作用［7］,在還原劑的存在的情況下,PQQ可誘導(dǎo)發(fā)超氧化還原反應(yīng)。而在氧化應(yīng)激情況下,它又可以發(fā)揮氧化作用而防止細(xì)胞損傷［8-10］。本研究利用PQQ進(jìn)行動(dòng)物骨關(guān)節(jié)炎的干預(yù)處理,旨在觀察PQQ對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨是否具有保護(hù)作用,并對(duì)其可能的效應(yīng)機(jī)理作出探討,從而為PQQ骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 鼠抗兔II型膠原抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、TUNEL凋亡試劑盒(Invitrogen公司、美國(guó))、吡咯喹啉醌(Sigma公司、美國(guó))等。石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、恒溫箱、冰箱、烤箱、手術(shù)小圓刀、眼科剪、眼科鑷、皮拉勾、淺肌鉤、刀柄、有齒鑷、無齒鑷、血管鉗、持針器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡健康日本大耳白兔36只雌雄均可,平均體質(zhì)量2.4 kg(購(gòu)自武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室,SPF級(jí),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證編號(hào)SCXK2008-0003),分籠飼養(yǎng)。動(dòng)物房溫度22℃～26℃,飼料供給充足,籠中飲用水充足、衛(wèi)生。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d之后,用3%戊巴比妥納35mg/kg靜脈麻醉,右側(cè)膝關(guān)節(jié)行經(jīng)典Hulth法造模:麻醉起效后將其固定在手術(shù)臺(tái)上,術(shù)區(qū)備皮,活力碘消毒后常規(guī)鋪巾。取右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕骨旁切口,切開皮膚,皮下筋膜和關(guān)節(jié)囊,暴露前交叉韌帶。直視下切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板、和內(nèi)側(cè)副韌帶,注意不要損傷關(guān)節(jié)軟骨。行抽屜試驗(yàn)確認(rèn)前交叉韌帶已完全切斷后,生理鹽水沖洗后將髕骨復(fù)位,用4-0絲線縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚。術(shù)后第二天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即恢復(fù)正?；顒?dòng)。偽手術(shù)組僅打開關(guān)節(jié)囊,不損傷關(guān)節(jié)軟骨、交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板和內(nèi)側(cè)副韌帶,然后用生理鹽水反復(fù)沖洗后逐層關(guān)閉切口,行抽屜實(shí)驗(yàn)與左側(cè)膝關(guān)節(jié)對(duì)比以確認(rèn)前交叉韌帶已完全切斷。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥:術(shù)后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組,分別為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及偽手術(shù)組,每組12只。實(shí)驗(yàn)組給術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射104μmol/L吡咯喹啉醌0.2mL/kg,每3天注射1次,連續(xù)6周。對(duì)照組術(shù)后給膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等量的生理鹽水,每3天注射1次。偽手術(shù)組不給予藥物處理。

標(biāo)本采集前檢測(cè)及標(biāo)本大體觀察:手術(shù)后第6周,將各組動(dòng)物用3%戊巴比妥納35mg/kg靜脈麻醉后,仰臥位行膝關(guān)節(jié)正位X線片,并根據(jù)Kellgren-Lawrance分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,完成X線檢測(cè),空氣栓塞法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死。肉眼大體觀察并記錄股骨髁關(guān)節(jié)面的病理改變,并行軟骨Pelletier JP評(píng)分。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)切片制備準(zhǔn)備:處死全部動(dòng)物并大體觀察后,截取右膝股骨下端,剔除周圍軟組織,沖洗干凈將組織浸泡在10%的中性福爾馬林中,4℃下固定24 h;脫鈣固定完成后,PBS充分浸洗,流水沖洗2 h,15%乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTA)脫鈣,每5天更換脫鈣液,4周后針刺組織無明顯阻力感,說明脫鈣已完全。修整組織塊,保留股骨內(nèi)側(cè)髁,流水沖洗1～2 h;脫水梯度酒精脫水:沖洗后的標(biāo)本入70%酒精2 h,80%酒精2 h,95%酒精2 h,95%酒精2 h,無水酒精2 h,無水酒精2 h;透明二甲苯中沖洗2次,每次20min;浸蠟組織透明后取出放入事先融化好的56℃的石蠟中浸蠟兩次,每次30min;包埋浸蠟完成后,將組織放入裝滿融化石蠟的包埋框中,冷卻;切片將蠟塊裝到切片機(jī)上,切片厚度定為5μm,行關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨全層不連續(xù)切片,每個(gè)標(biāo)本切9張,間隔100μm切片。用攝子輕輕將切片放入47℃溫水中展平,撈片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析;以P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線攝片檢測(cè)膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變 偽手術(shù)組(圖1A)見股骨髁軟骨表面光滑且無骨質(zhì)增生跡象,關(guān)節(jié)間隙無明顯改變。實(shí)驗(yàn)組(圖1B)見股骨內(nèi)髁邊緣模糊,關(guān)節(jié)間隙較偽手術(shù)組小,可見少量骨質(zhì)增生,且脛骨平臺(tái)表面欠光滑。對(duì)照組(圖1C)見關(guān)節(jié)間隙明顯變窄,軟骨骨化嚴(yán)重,有大量骨贅,且有毛刺樣增生,脛骨平臺(tái)骨質(zhì)破壞嚴(yán)重。

通過3組X線片影像學(xué)積分可知,偽手術(shù)組(1.46±0.42)分,實(shí)驗(yàn)組(0.08±0.04)分,對(duì)照組(2.75±0.60)分,實(shí)驗(yàn)組積分較對(duì)照組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

關(guān)節(jié)軟骨切片的染色:骨組織石蠟切片脫蠟入水,蒸餾水洗;蘇木素染液染細(xì)胞核5～10min;水洗,去除余色;1%鹽酸酒精分色數(shù)秒;流水漂洗,直至組織切片充分藍(lán)化;伊紅染液染細(xì)胞質(zhì)2min,自來水沖洗;入梯度酒精脫水;二甲苯透明,中性樹膠封片。

圖1 X線攝片檢測(cè)膝關(guān)節(jié)影像學(xué)改變Fig.1 X ray radiography testing knee imaging changes

2.2 大體觀察 偽手術(shù)組(圖2A)軟骨表面光滑,透明度高,未見潰瘍和軟骨缺損。實(shí)驗(yàn)組(圖2B)膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面大部分平整,部分部位可見達(dá)軟骨缺損,及少量骨贅生成。對(duì)照組(圖2C)可見關(guān)節(jié)面粗糙不平整,無光澤,顏色暗紅,部分軟骨表面可見深達(dá)軟骨中層和深層的裂隙和缺損,軟骨面結(jié)構(gòu)幾乎完全破壞,多處軟骨剝脫且可見軟骨下骨,并且可以見大量骨贅生成。

圖2 脛骨關(guān)節(jié)面大體觀察Fig.2 Tibial articular surface gross observation

2.3 光鏡下觀察HE染色 偽手術(shù)組(圖3A)軟骨基質(zhì)染色均勻,軟骨表面無裂隙,細(xì)胞排列有序,結(jié)構(gòu)清晰、無細(xì)胞簇集現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組(圖3B)軟骨細(xì)胞局部彌漫增生簇集,軟骨細(xì)胞減少,排列紊亂等。對(duì)照組(圖3B)軟骨表中層細(xì)胞數(shù)彌漫性增多,并出現(xiàn)簇集樣細(xì)胞團(tuán),部分標(biāo)本軟骨表面出現(xiàn)裂隙及深達(dá)中層的糜爛。

圖3 HE染色軟骨光鏡下觀察結(jié)果Fig.3 Observation results of cartilage HE staining under lightmicrosoope

2.4 TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡結(jié)果 從對(duì)照組(圖4C)可見軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于實(shí)驗(yàn)組(4B),而偽手術(shù)組(圖4A)偶見凋亡的軟骨細(xì)胞。由圖4可見,偽手術(shù)組:正常的軟骨細(xì)胞II型膠原均勻分泌、膠原纖維密集、平行分布。實(shí)驗(yàn)組:軟骨細(xì)胞II型膠原合成介于偽手術(shù)組和對(duì)照組之間。對(duì)照組:軟骨淺層II型膠原缺失。

圖4 PQQ對(duì)軟骨細(xì)胞II型膠原合成的影響Fig.4 PQQ effects on collagen synthesis of cartilage cell type II

2.5 軟骨細(xì)胞線粒體在電鏡下的形態(tài)和數(shù)目的改變 從實(shí)驗(yàn)組(圖5A)可見線粒體較對(duì)照組顯著增多,而對(duì)照組(圖5B)軟骨細(xì)胞線粒體在視野中未見。

圖5 軟骨細(xì)胞線粒體在電鏡下的改變Fig.5 Cartilage cellsmitochondrial changes under electron microscope

3 結(jié)論

吡咯喹啉醌對(duì)關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用的機(jī)制尚屬探索階段。有許多試驗(yàn)報(bào)告顯示,軟骨細(xì)胞生存依賴能量代謝,軟骨基質(zhì)的合成與礦化是由ATP生成與消耗的動(dòng)態(tài)平衡所調(diào)節(jié)的。因此軟骨細(xì)胞內(nèi)線粒體是能量的重要的細(xì)胞器,因此ATP生成和消耗失衡不僅影響基質(zhì)的合成,而且會(huì)導(dǎo)致軟骨的鈣化。

吡咯喹啉醌是一種氧化還原酶的輔酶。動(dòng)植物體內(nèi)和人體內(nèi)都含有一定量的PQQ,它參與廣泛的生物學(xué)功能,在氧化應(yīng)激環(huán)境下,它可發(fā)揮抗氧化作用而防止細(xì)胞受損［11］,同時(shí) Stites［6］、Rucker［10］等國(guó)外科學(xué)家研究表明PQQ可以促進(jìn)線粒體的生成。本研究可以觀察到在實(shí)驗(yàn)組透射電鏡線粒體數(shù)量明顯高于對(duì)照組,從而證明PQQ具有保護(hù)或促進(jìn)線粒體生成效應(yīng),提示它可以治療線粒體功能不足所造成的相關(guān)疾病,從而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。軟骨細(xì)胞線粒體對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡也有重要作用,主要與能量代謝也有關(guān)系。膠原是軟骨的主要組成部分,而II型膠原占軟骨干重的約60,且II型膠原是維持軟骨空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要部分,故II型膠原量的改變對(duì)OA的形成是一項(xiàng)很重要的因素,如果II型膠原減少必定引起關(guān)節(jié)軟骨的改變,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PQQ可以促進(jìn)II型膠原的合成或減少II型膠原的分解,因此這也是吡咯喹啉醌保護(hù)軟骨的作用機(jī)制之一。

OA最主要的病變是關(guān)節(jié)軟骨的退變,現(xiàn)階段的主要治療手段除了嚴(yán)重的OA通過手術(shù)來解決以外,其他治療方法主要是緩解炎癥和保護(hù)骨關(guān)節(jié)軟骨。而本實(shí)驗(yàn)正是通過保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨來治療OA的,且實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),PQQ對(duì)OA的預(yù)防和治療有一定的療效。

目前,本研究在國(guó)內(nèi)首次采用兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PQQ來進(jìn)行OA治療的研究,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PQQ可以有效控制骨關(guān)節(jié)軟骨的退變,但是機(jī)理不是完全清楚,將做進(jìn)一步的研究。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)所給關(guān)節(jié)腔PQQ的濃度是否為最佳治療濃度,也不是完全的清楚,需要進(jìn)一步的研究。

［1］ Hauge JG.Glucose dehydrogenase of bacterium anitratum:an enzyme with a novel prosthetic group［J］.J Biol Chem， 1964， 239（2):3630-3639.

［2］ Salisbury SA，F(xiàn)orrest HS， Cruse WB， et al.A novel coenzyme from bacterial primary alcohol dehydrogenases［J］.Nature， 1979， 280（5725):843-844.

［3］ Westerling J，F(xiàn)rank J， Duine JA.The prosthetic group of methanol dehydrogenase from Hyphomicrobium X:electron spin resonance evidence for a quinone structure［J］.Biochem Biophys Res Commun，1979，87 （3):719-724.

［4］ Matsushita K，Toyama H，Yamada M，et al.Quinoproteins:structure，function， and biotechnological app lications［J］.App lMicrobiol Biotechnol， 2002， 58（1):13-22.

［5］ Anthony C.Pyrroloquinoline quinone（ PQQ)and quinop rotein enzymes［J］.Antioxid Redox Signal， 2001， 3（1):757-274.

［6］ Stites TE， Mitchell AE， Rucker RB.Physiological importance O-quinone family of cofactors［J］.JNutr， 2000， 130（1):719-727.

［7］ Bishop A，Gallop PM，Karnovsky ML，etal.Pyrroloquinonline quinine:a novel vitamin? ［J］.Nutr Rev， 1998， 56（2):287-293.

［8］ Zhang Y，Rosenberg PA.The essential nutrient Pyrroloquinoline quinine may actas a neuroprotectant by suppressing peroxynitrite formation［J］.Eur JNeurosci， 2002， 16:1015-1024.

［9］ He K，Nukada H， Urakami T， et al.Antioxidant and pro-oxidant properties of Pyrroloquinoline quinine（PQQ):implications for its function in biological systems［J］.Biochem Pharmacol，2003， 65（1):67-74.

［10］ Rucker R， Chowanadisai W.and Nakano M.Potential Physiological Importance of Pyrroloquinoline Quinone［J］.ALTERNATIVE MEDICINE REVIEW，2009，14（3):268-277.

［11］ Stites T， Storms D， Bauerly K， et al.Pyrroloquinoline quinine modulatesmitochondrial quantity and function in mice［J］.J Nutr，2006， 136（2):390-396.

［12］ Rucker RB，Chowanadisai W， Tchaparian E， et al.Pyrroloquinoline quinine and mitochondriogenesis［J］.Mitochondrion， 2009，14（3):268-277.

［13］ ChowanadiaiW，Bauerly K， Tchaparian E， et al.Pyrroloquinoline quinone（PQQ)stimulates mitochondrial biogenesis［J］.Faseb Journal， 2010，285（1):145-152.

［14］ ChowanadisaiW，Bauerly KA，Tchaparian E，et al.Pyrroloquinoline Quinone Stimulates Mitochondrial Biogenesis through cAMP Response Element-binding Protein Phosphorylation and Increased PGC-1 alpha Expression［J］.JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY， 2010，285（1):142-152.

［15］ Urakami T，Yoshida C， Akaike T， et al.Synthesis of monoesters of Pyrroloquinoline quinine and in idazopyrroloquinoline and radial scavenging activities using electron spin resonance in vitro and pharmacological activity in vivo［J］.JNutr Sci Vitaminol， 1997， 43（1):19-33.

(編校:譚玲)

Study on the protection mechanism of the pyrroloquinoline quinone for osteoarthritis on rabbits

WANG Lai-fang1,DING Yan-jie1,ZHAO Qing1△,CHEN Li-juan2

(1.Department of Rheumatology,The Huaihe Hospital of Henan University,Kaifeng 475000,China;
2.Division of Medical Sciences,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To study the protectionmechanism of the pyrroloquinoline quinone(PQQ)for osteoarthritis on rabbits.Methods Sixmonths of aged 36 Japanesewhite rabbitsasexperimental subjects,were randomly divided into experimentalgroup and controlgroup and pseudo-operation group,each group had 12 rabbits.Knee anteroposterior X-ray film,and in accordance with Kellgren-Lawrance's grading score was observed under an operating microscope articular cartilage of femoral condyle parallelmorphological changes in the general rate of cartilage Pelletier JP,HE sections in the light microscope,and in accordance with the Mankin score sheet score,in the light microscope and the apoptosis of cartilage type II collagen immunohistochemical staining and electron microscopy of chondrocytes in the form.Results The experimental group Kellgren-Lawrance score was significantly lower than the control groups(P＜0.05);The experimental group and the control group cartilage cellmitochondria number had significant difference under electron microscope.Conclusion Intra-articular injection in osteoarthritis of PQQ to protect cartilage cells,thereby reducing the structure and function of articular cartilage damage and promote cartilagemetabolism and repair itself.PQQ may be to protect the articular cartilage by protecting cartilage Unitochondria.

osteoarthritis;pyrroloquinoline quinone;chondrocytes

R7

A

1005-1678（2014)06-0059-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071946)

王來芳，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：風(fēng)濕，R-mail：qch1821460030@163.com。