葛根素聯(lián)合丹皮酚對(duì)三種2型糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織變化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的影響

蘇立平,陳立,薛明明,蘇立軍,祁朋,何蕾,侯石磊

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059;2.中國(guó)國(guó)際航空內(nèi)蒙古分公司 航醫(yī)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

葛根素聯(lián)合丹皮酚對(duì)三種2型糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織變化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的影響

蘇立平1,陳立2Δ,薛明明1,蘇立軍3,祁朋3,何蕾3,侯石磊3

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059;2.中國(guó)國(guó)際航空內(nèi)蒙古分公司 航醫(yī)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

目的 探討葛根素聯(lián)合丹皮酚對(duì)3種2型糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織變化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的影響。方法 分別采用特殊膳食誘導(dǎo)法、注射鏈脲菌素（STZ)、特殊膳食加注射STZ法構(gòu)建2型糖尿病動(dòng)物模型，取造模成功的3種Wistar大鼠，每種40只。將各模型隨機(jī)分為糖尿?。―M)組、單用葛根素（Pue)組、單用丹皮酚（Pae)組和葛根素聯(lián)合丹皮酚（Pue+Pae)組，每組10只。試驗(yàn)進(jìn)行8周后測(cè)定每種模型的4組大鼠的胰腺線粒體中的ROS、SOD及MDA；Western blot方法檢查處理后的腎周圍脂肪組織細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的含量。結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有動(dòng)物死亡，全部進(jìn)入結(jié)果分析。Pue組、Pae組及Pue+Pae組較DM組大鼠胰腺線粒體SOD活性有顯著升高（P＜0.01)，而MDA、ROS水平呈現(xiàn)不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05)，其中Pue+Pae組變化更加明顯（P＜0.01)；設(shè)定每種模型DM組的脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的吸光度為1，其它組數(shù)據(jù)與DM組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，且Pue+Pae組是DM組的2～3倍（P＜0.01)。結(jié)論 葛根素聯(lián)合丹皮酚組能降低3種2型糖尿病模型胰腺組織中的MDA、ROS水平、升高SOD水平；葛根素聯(lián)合丹皮酚治療組能提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4蛋白的含量。

葛根素；丹皮酚；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

糖尿病是由于胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的代謝紊 亂性疾?。?］,主要表現(xiàn)為慢性高血糖,伴有糖尿,口渴多飲,多尿,多食的一種臨床綜合征［2］。2型糖尿?。?］是糖尿病的一種,也叫胰島素非依賴性糖尿病,是因胰島素分泌相對(duì)不足或靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低引起的糖尿病。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展,人民生活水平的不斷提高,人民的生活方式發(fā)生了很大改變,糖尿病的發(fā)病率不斷上升［4］,其中2型糖尿病占絕大多數(shù),嚴(yán)重威脅患者的健康和生活質(zhì)量。

葛根素(Puerarin)是葛根的主要活性成分之一,葛根素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管;減慢心率,降低心肌耗氧量;抗脂質(zhì)過(guò)氧化和消除自由基,降血糖降血脂等藥理作用［5-7］。葛根素的藥理活性較強(qiáng),藥效明確,安全范圍廣,不良反應(yīng)少,且葛根資源豐富,價(jià)格低廉,臨床應(yīng)用廣泛。李娟娟等［8］發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)胰島素抵抗大鼠脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4有影響,張雷等［9］研究發(fā)現(xiàn)葛根素很有可能成為治療糖尿病的首選藥物。丹皮酚(Paeonol Pae)又稱牡丹分,是中藥牡丹皮的主要活性成分之一。丹皮酚［10］藥理活性廣泛,在心腦血管、腫瘤、炎癥等方面有重要應(yīng)用。本研究旨在探討葛根素聯(lián)合丹皮酚對(duì)3種2型糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織變化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠(SPF級(jí))120只,8周齡,體質(zhì)量200～250 g,購(gòu)自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所(合格證醫(yī)動(dòng)字第310201012);鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)購(gòu)自Sigma公司,活性氧(ROS)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,葛根素注射液購(gòu)自海南斯達(dá)制藥有限公司(批號(hào):200223186),丹皮酚購(gòu)自西安小草植物科技有限公司(批號(hào):7089003)。

1.2 模型制備及分組 第一種2型糖尿病模型采用特殊膳食誘導(dǎo),具體做法:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后,將40只大鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng),在基礎(chǔ)飼料中添加20%蔗糖、10%熟豬油、2.5%膽固醇、1%膽酸鹽混合即成。10周后空腹72 h測(cè)血糖濃度,2次均≥16.7mmol/L［9］為成功模型。

第二種2型糖尿病模型采用注射鏈脲菌素(STZ),具體做法:將40只大鼠禁食16～20 h后,一次性尾部靜脈注射STZ(60.0 mg/kg),若血糖濃度大于20.0 mmol/L并伴有多尿等其他糖尿病癥狀定為由其誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠造模成功。

第三種2型糖尿病模型采用特殊膳食加注射STZ法,具體做法:40只大鼠注射中劑量STZ(30 mg/kg)加以高糖高脂飲食(總熱能7 J/g,蛋白質(zhì)占24%,碳水化合物占54%,脂肪占4%)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)均以“±s”表示,2組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組動(dòng)物模型胰腺線粒體中的MDA、ROS、SOD水平比較 與DM組比較,Pae組、Pue組及Pue+Pae組大鼠胰腺線粒體MDA和ROS水平均有不同程度的降低,而SOD活性均明顯升高,其中Pue+Pae組變化更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01,見(jiàn)表1)。喂養(yǎng)10周后空腹3 d測(cè)血糖,血糖濃度在11.1～33.3mmol/L之間為造模成功。

將每種模型的40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為糖尿病組(DM)、葛根素治療組(Pue)、丹皮酚治療組(Pae)、葛根素加丹皮酚治療組(Pue+Pae),每組10只大鼠,Pue組大鼠腹腔注射葛根素注射液165 mg/(kg·d),Pae組丹皮酚(1.25 mg/kg)灌胃,Pue+Pae組先給予大鼠腹腔注射與Pue組等濃度的葛根素注射液,然后用Pae組等濃度的丹皮酚灌胃,DM組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水溶液,共持續(xù)8周。

飼養(yǎng)的環(huán)境:明暗各12 h,溫度保持在20～24℃,相對(duì)濕度保持在50%～70%范圍內(nèi)。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》的相關(guān)規(guī)定。

1.3 觀察指標(biāo) 胰腺組織處理之后觀察胰腺線粒體中的MDA、ROS、SOD水平;Western blot方法觀察各組大鼠脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4含量變化。

1.4 胰腺組織處理和指標(biāo)測(cè)定 4組大鼠禁食12 h后每組取5只剖腹取出胰腺,沖洗,擦干,去除脂肪,稱其質(zhì)量,用冷卻過(guò)后的生理鹽水制成一定濃度的組織勻漿,然后離心,離速2000 r/min,時(shí)間10 min,取上清液,然后以1100 r/min的離速低溫離心20min,沉淀,然后用冰冷的生理鹽水制成線粒體的懸浮液,超聲細(xì)胞粉碎儀破碎線粒體,按照試劑盒的說(shuō)明測(cè) MDA、ROS、SOD水平。

每組將剩余的5只大鼠麻醉后,立即取出大鼠腎周圍的脂肪組織,稱重,按照Western blot操作方法操作,最后用 Sigmagel軟件對(duì)X射線膠片上進(jìn)行陽(yáng)性信號(hào)處理。加樣量誤差由β-actin進(jìn)行矯正。

表1 3組動(dòng)物模型胰腺組織線粒體MDA、ROS、SOD水平比較Tab.1 Comparison of animal pancreas tissuemitochondrial MDA,ROS,SOD levels in threemodels

2.2 3組動(dòng)物模型大鼠脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4含量檢測(cè) 3組動(dòng)物模型大鼠脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。將每種模型DM組脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的吸光度設(shè)定為1,Pue治療組、Pae治療組、Pue+Pae治療組脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的吸光度見(jiàn)表2。Pue+Pae治療組為DM組的2～3倍。

圖1 Western blot法檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4Fig.1 The expression of glucose transporter 4 detected by western blot in eachmodel

表2 3組動(dòng)物模型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4吸光度比較Tab.2 Comparison of the absorbance of glucose transporter 4 in threemodels

3 討論

特殊飲食誘導(dǎo)大鼠糖尿病的發(fā)病率較低［11］,目前國(guó)內(nèi)主要以高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素為最常用的2型糖尿病大鼠造模方式。本研究表明,與DM組大鼠比較,Pue+Pae組大鼠胰腺組織中ROS、MDA水平明顯降低,SOD活性增強(qiáng),表明葛根素聯(lián)合丹皮酚可通過(guò)增強(qiáng)糖尿病大鼠胰島組織抗氧化酶的活性,加強(qiáng)對(duì)自由基的清除力度,減輕自由基對(duì)胰島β細(xì)胞的過(guò)氧化損傷,保護(hù)了胰島β細(xì)胞的功能。

胰島素抵抗是糖尿病發(fā)病的機(jī)制之一［12］,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制障礙是胰島素抵抗的重要方面［13-14］,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4在胰島素的刺激下,通過(guò)異位作用轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜上［15］,促進(jìn)葡萄糖在脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存起來(lái),實(shí)驗(yàn)中3種模型的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4含量均增加,意在說(shuō)明葛根素、丹皮酚或2者聯(lián)合通過(guò)增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的含量降低血糖含量,從而起到預(yù)防或治療2型糖尿病的效果。2者配伍之后降低了胰腺組織細(xì)胞的MDA、ROS水平,提升了SOD水平,增加了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的含量,但是2者配伍后,葛根素和丹皮酚之間是如何發(fā)生相互作用及相關(guān)的作用機(jī)制尚不清楚,可以考慮從藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)或其他方面去研究。

綜上,葛根素聯(lián)合丹皮酚可有效降低3種2型糖尿病動(dòng)物模型胰腺組織中MDA、ROS的水平,上調(diào)SOD的水平,并且增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)。

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(編校:吳茜)

Effect of puerarin combined w ith paeonol on pancreatic tissue and glucose transporter 4 in three ratmodels w ith type 2 diabetesmellitus

SU Li-ping1,CHEN Li2,XUE Ming-ming1,SU Li-jun3,QIPeng3,HE Lei3,HOU Shi-lei3

(1.Basicalmedical laboratory,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China;2.Aviation Medical room,Inner Mongolia Branch of Air China International Hohhot010070,China;3.The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China)

Objective To investigate the effectof puerarin combined with paeonol on pancreatic tissue and glucose transporter4 in threemodels of animalwith type 2 diabetes mellitus.Methods 120 Wistar rats modelled by special diet-induced method,injection of streptozotocin(STZ),special dietary plus STZ injection method respectively were randomly divided into 3 parts,40 rats in each part,each partwas used to study amodel,and each model was random ly divided into diabetic(DM)group,puerarin(Pue)group,paeonol(Pae)group and puerarin combined with paeonol(Pue+Pae)group.After 8-week treatment,ROS,SOD and MDA ofmitochondria weremeasured in 4 rats of each model in the pancreas.Western blotwas used to detect the expression of GLUT4 in adipocytes.Results No animal died during the experiment,allwere involved in the result analysis.The SOD activity of Pae group pue group and(Pue+Pae)group were all significantly increased(P＜0.01),while MDA、ROS decreased(P＜0.01,or P＜0.05)this change in(pue+pae)group wasmore obvious(P＜0.01);the absorbance of GLUT4 of the model group was represented by 1,the other group of data was compared with DM group,therewere significant differences(P＜0.05)and the(Pue+Pae)group was2～3 times DM group(P＜0.01).Conclusion MDA,ROS levelwere reduced and SOD level was improved;puerarin combined with paeonol treatment group can improve the glucose transporter 4 protein content.

puerarin;paeonol;glucose transporter 4

R285.5；R322.4+91；R335+.6

A

1005-1678（2014)06-0041-03

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(2013MS1143)

蘇立平，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，E-mail：suliping1975@163.com；陳立 ，通信作者，女，主治醫(yī)師，研究方向：內(nèi)科學(xué)、航醫(yī)學(xué)，E-mail：Blueice@qq.com。