CIK細(xì)胞聯(lián)合紫杉醇治療上皮性卵巢癌的初步研究

肖梅 艾月琴 張闖 張燕 高艷榮 胡建華 賈紹昌

卵巢位于腹腔深部，目前缺少有效的診斷方法，首發(fā)初診時(shí)70%～80%患者已經(jīng)是中晚期，在女性生殖器官惡性腫瘤中，其死亡率居于首位[1]。上皮性卵巢癌約占卵巢癌的90%，目前腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)加紫杉醇/鉑類聯(lián)合化療的治療方法，可暫時(shí)緩解病情，然而復(fù)發(fā)率卻高達(dá)85%，晚期患者5年生存率仍然低于30%[2-3]。傳統(tǒng)認(rèn)為，上皮性卵巢癌不具有免疫原性，近來(lái)研究表明，上皮卵巢癌患者體內(nèi)存在免疫應(yīng)答，更多的臨床證據(jù)顯示，抗腫瘤免疫效應(yīng)與免疫逃避機(jī)制之間的關(guān)系預(yù)示著更好或者更差的生存率[4]。CIK細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)得來(lái)的一群異質(zhì)細(xì)胞，兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷（nature kill，NK）細(xì)胞的非組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)，是生物治療中常用的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。本研究旨在探討上皮性卵巢癌患者中運(yùn)用自體CIK細(xì)胞輸注同步紫杉醇化療的綜合治療方法的安全性和有效性。2011年11月-2013年11月，筆者對(duì)17例卵巢癌患者在紫杉醇+卡鉑治療時(shí)同步進(jìn)行了多次自體CIK細(xì)胞輸注，檢測(cè)治療前后患者淋巴細(xì)胞亞群和血清細(xì)胞因子，觀察其臨床療效和不良反應(yīng)，隨訪至治療結(jié)束后第3個(gè)月?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年11月-2013年11月共17例患者入選，均經(jīng)病理證實(shí)為上皮性卵巢癌，其中12例為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后仍殘存病灶>1 cm，均為術(shù)后2周內(nèi)開始化療；5例為初診時(shí)無(wú)法手術(shù)，經(jīng)2周期化療后行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，仍殘存病灶>1 cm；12例治療開始時(shí)有腹水。年齡40～64歲，平均55歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于18歲的卵巢癌患者；重要臟器功能正常，無(wú)自身免疫疾病，卡氏評(píng)分在60分以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕或哺乳期婦女，臟器移植者：如肝、心臟和腎等，嚴(yán)重的不可控制的感染，阻礙簽署及理解知情同意者。

1.2 主要材料 rhIL-1α為PeproTech產(chǎn)品，CD3單抗為古巴分子免疫學(xué)中心 （Cuba CIMAB S.A.）產(chǎn)品。rhIL-2購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)。rhIFN-γ購(gòu)自上海凱茂藥業(yè)，F(xiàn)icoll分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。無(wú)血清培養(yǎng)基GT551為寶日醫(yī)公司產(chǎn)品，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湛江博康公司。流式抗體試劑為BD公司產(chǎn)品，細(xì)胞因子ELISA試劑盒為R&D Systems公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 CIK體外誘導(dǎo) 所有患者均于化療開始前1 d采血。采用費(fèi)森尤斯卡比公司的血細(xì)胞分離機(jī)COM.TEC采集患者外周單個(gè)核細(xì)胞約60 mL，常規(guī)Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，重懸細(xì)胞后鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入含100 ng/mL rhIFN-γ的培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h后，添加終濃度 為 50 ng/mL CD3、50 ng/mL rhIL-1α、500 U/mL rhIL-2。培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)添加含500 U/mL rhIL-2的新鮮培養(yǎng)基。至培養(yǎng)的第10天、第12天、第14天收獲成熟CIK，通過(guò)形態(tài)學(xué)、特異性表面標(biāo)記等進(jìn)行鑒定，真菌、細(xì)菌、內(nèi)毒素檢測(cè)合格后方可進(jìn)行CIK回輸，同時(shí)終產(chǎn)品留樣備查。按《中華人民共和國(guó)藥典》2010版第三部規(guī)定的方法進(jìn)行內(nèi)毒素和無(wú)菌的檢測(cè)。以上操作均在符合GMP條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3.2 方法 自體采血，次日開始化療，化學(xué)治療結(jié)束后第8天開始CIK回輸，每次間隔1天，共3次，每次（1～2）×109個(gè)CIK細(xì)胞。CIK回輸結(jié)束2周后進(jìn)行第2次化學(xué)治療，同樣再次注射CIK，最少治療2個(gè)周期?；煼桨笧門C方案，當(dāng)天給予紫杉醇135 mg/m2，>3 h靜脈滴注，次日給予卡鉑?？ㄣK劑量根據(jù)患者腎功能情況確定，卡鉑（mg）=AUC×（GFR+25），GFR為患者的腎小球?yàn)V過(guò)率，單位為mL/min，AUC值取6。

1.3.3 臨床觀察 療程治療開始前l(fā)周及療程治療結(jié)束后2周內(nèi)進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，包括全面的病史采集，體格檢查及血常規(guī)、肝腎功能的檢查，嚴(yán)格觀察不良反應(yīng)的發(fā)生情況。在每次細(xì)胞輸注后30 min及24 h，按《抗腫瘤藥物急性與亞急性毒性反應(yīng)分度級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》觀察患者是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。主要毒性反應(yīng)為骨髓抑制、脫發(fā)、神經(jīng)毒性和胃腸道反應(yīng)。細(xì)胞免疫前2 d和細(xì)胞免疫結(jié)束后1周，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的比率以及檢測(cè)血清Th1型細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）的水平。按實(shí)體瘤治療療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞亞群 治療后患者外周血T細(xì)胞亞群分析顯示，CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞比例較治療前明顯升高（P<0.05），CD3+CD4+比例和CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例下降，見表1。

表1 治療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化（±s） %

表1 治療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化（±s） %

*與治療前比較，P<0.05

時(shí)間 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3+CD56+ CD4+CD25+治療前（n=17） 57.23±13.20 31.53±13.03 35.16±15.12 12.35±5.28 2.48±1.02治療后（n=17） 63.69±14.52* 29.64±14.19 40.64±10.56* 16.17±5.18* 1.83±0.81

2.2 細(xì)胞因子水平的變化 患者治療前后Th1型細(xì)胞因子分析顯示，與治療前比較，治療后患者血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平顯著提高（P<0.05），其中以IFN-γ水平治療后升高最為顯著，見表2。

表2 治療前后細(xì)胞因子變化（±s） pg/mL

表2 治療前后細(xì)胞因子變化（±s） pg/mL

*與治療前比較，P<0.05；△與治療前比較，P<0.01

時(shí)間 IL-2 IFN-γ TNF-α治療前 28.4±18.9 17.95±9.30 29.6±12.3治療后 47.5±20.1* 48.2±21.2△ 43.7±14.8*平均升高倍數(shù) 1.67±0.90 2.68±2.30 1.85±0.80

2.3 近期療效 17例可評(píng)價(jià)病灶患者中，2例完全緩解（CR），13例部分緩解（PR），2例穩(wěn)定（SD）。有效率（CR+PR）為88%。12例患者腹水緩解明顯。由于部分患者繼續(xù)接受化療影響，患者的生活質(zhì)量改善情況無(wú)法評(píng)價(jià)?？ㄊ显u(píng)分提高的患者有10例，其中尤以納差、食欲和睡眠改善最為明顯；體重增加有4例。2.4 毒性反應(yīng) 未出現(xiàn)Ⅳ度粒細(xì)胞、血小板減少及Ⅳ度貧血。所有患者中，經(jīng)預(yù)防性應(yīng)用止吐藥物，16例患者發(fā)生輕微胃腸道反應(yīng)；15例患者發(fā)生脫發(fā)；10例患者有肌肉酸痛手腳麻木畏冷等。CIK細(xì)胞輸注后，2例患者24 h內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫均低于39 ℃，未給予特殊處理，在6～24 h內(nèi)恢復(fù)正常，未出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭痛等癥狀，未發(fā)現(xiàn)Ⅲ度及以上不良反應(yīng)，表明細(xì)胞免疫治療是安全的，無(wú)明顯毒副作用。

3 討論

卵巢癌有強(qiáng)大的免疫逃避的能力，其腫瘤細(xì)胞與宿主免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)之間搭建了一個(gè)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。在腫瘤微環(huán)境中，免疫抑制作用增強(qiáng)，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平，細(xì)胞因子如白介素-10（interleukin-10，IL-10）、 白 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）、 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞從治療中逃逸[5-7]。卵巢癌患者多數(shù)一線治療后緩解期短暫，85%患者在化療后復(fù)發(fā)，而且復(fù)發(fā)的中位時(shí)間不到2年，晚期上皮性卵巢癌的治療迫切需要尋找更為有效的治療手段。

細(xì)胞免疫治療以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。由于化療藥物的骨髓抑制性，傳統(tǒng)觀念一般認(rèn)為化療和細(xì)胞免疫治療不相容，近年來(lái)越來(lái)越多研究表明，在循證、規(guī)范的綜合治療原則下，這兩者不僅能相容，而且能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。在實(shí)體瘤治療中，雖然化療常常引起腫瘤患者中性粒細(xì)胞減少癥（neutropenia），但很少發(fā)生淋巴細(xì)胞減少癥（lymphopenia），這表明化療不削弱免疫效應(yīng)細(xì)胞功能[8]?；煂?duì)免疫系統(tǒng)有一些有益的影響，如化療能對(duì)髓系來(lái)源抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）以及/或者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）產(chǎn)生影響；增加腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性或?qū)е履[瘤細(xì)胞免疫原性增加，以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)等方式增強(qiáng)免疫治療效果[9-10]；同時(shí)，免疫治療能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性并降低化療的毒性作用等。細(xì)胞免疫治療與化療的聯(lián)合使用可作為腫瘤治療中一種合理方案[11]。

紫杉醇加鉑類的方案是治療卵巢癌的主要一線化療藥物，主要是通過(guò)將細(xì)胞阻滯于G2/M期，使癌細(xì)胞復(fù)制受阻死亡。紫杉醇主要的毒性反應(yīng)有：過(guò)敏、骨髓抑制、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)和肝臟毒性等，毒性反應(yīng)的大小具有劑量相關(guān)性。自體CIK細(xì)胞輸注是將外周血中的單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞，其中的主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD8+T細(xì)胞和CD3+CD56+NK樣T細(xì)胞。徐梅等[12]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞能誘導(dǎo)卵巢癌SKVO-3細(xì)胞的調(diào)亡，聯(lián)合CIK細(xì)胞能明顯增強(qiáng)紫杉醇對(duì)SKVO-3細(xì)胞的殺傷作用。Liu等[13]研究了上皮性卵巢癌手術(shù)及一線化療后CIK細(xì)胞的維持治療的療效，與對(duì)照組相比，細(xì)胞治療延長(zhǎng)了患者的無(wú)進(jìn)展生存期，但總生存率未有明顯獲益。

在國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)上，筆者采用TC方案化療同步輸注自體CIK細(xì)胞的方案治療晚期上皮性卵巢癌患者，最少治療2個(gè)周期，17例患者共治療52個(gè)周期，輸注156人/次自體CIK細(xì)胞，每次細(xì)胞數(shù)量>109個(gè)?？稍u(píng)價(jià)病灶的患者中，完全緩解率為11%，部分緩解率為76%，5例有腹水患者在治療后均腹水緩解。17例患者化療后的毒性反應(yīng)有不同程度的骨髓抑制、脫發(fā)、神經(jīng)毒性和胃腸道反應(yīng)等。CIK輸注未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，80%患者主訴CIK輸注后，胃腸道反應(yīng)減輕，精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好。杜鴻昱等[14]通過(guò)對(duì)卵巢癌患者TC方案化療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化分析發(fā)現(xiàn)，化療結(jié)束2周后CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞比例升高，CD3+CD8+細(xì)胞比例下調(diào)；楊海青等[15]報(bào)道卵巢癌患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例明顯偏高。有研究報(bào)道，單藥紫杉醇聯(lián)合CIK維持化療治療晚期卵巢癌患者后，CD3+、CD4+和NK細(xì)胞都有升高趨勢(shì)，CD3+CD8+稍有下降[16]。筆者對(duì)本組患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，治療后外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞比例較治療前明顯升高（P<0.05），同時(shí)CD3+CD4+比例和CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例下降。

Th1/Th2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過(guò)程中起著十分重要的作用，腫瘤患者的免疫抑制導(dǎo)致Th1反應(yīng)向Th2的漂移（Th1/Th2漂移），呈Th2類細(xì)胞因子強(qiáng)勢(shì)表達(dá)狀態(tài)[17]。最近的一項(xiàng)研究表明，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α通過(guò)CDKN2A–Rb信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞造成持久的細(xì)胞衰老和生長(zhǎng)停滯，說(shuō)明細(xì)胞因子的檢測(cè)有一定的意義[18]。卵巢癌患者體內(nèi)存在免疫應(yīng)答，一些臨床證據(jù)表明，抗腫瘤免疫效應(yīng)與免疫逃避機(jī)制之間的關(guān)系預(yù)示著更好或者更差的生存率[4]。因此，在對(duì)上皮性卵巢癌的綜合治療中化療方案同步輸注CIK細(xì)胞，增加患者應(yīng)急免疫調(diào)節(jié)以抵消免疫微環(huán)境的免疫抑制作用，是有積極意義的。本研究中患者卵巢癌患者經(jīng)治療后，外周血IFN-γ的水平和其它Th1類細(xì)胞因子IL-2、TNF-α的水平也明顯升高。說(shuō)明CIK治療能部分糾正患者的免疫抑制狀態(tài)，改善患者預(yù)后。

受患者樣本量和研究時(shí)間限制，本組患者未考察無(wú)進(jìn)展生存期和總生存率，在治療中筆者發(fā)現(xiàn)，TC方案化療同步輸注自體CIK細(xì)胞的晚期卵巢癌患者的腫瘤綜合治療方法，能部分糾正患者的免疫抑制，提高患者Th1類細(xì)胞因子水平，有腹水的患者腹水緩解明顯，毒性反應(yīng)溫和，耐受良好，治療順應(yīng)性好，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[1] Jemal A， Bray F， Center M M，et al.Global cancer statistics [J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2] Daudi S，Eng K H，Mhawech-Fauceglia P，et al.Expression and immune responses to MAGE antigens predict survival in epithelial ovarian cancer[J].PLoS One，2014，9（8）：e104 099.

[3]覃利菊.卵巢癌診斷和治療的現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11（19）：147-149.

[4] Lavoue V， Thedrez A， Leveque J，et al.Immunity of human epithelial ovarian carcinoma：the paradigm of immune suppression in cancer[J].J Transl Med，2013，11（1）：147.

[5] Therasse P， Arbuck S G， Eisenhauer E A， et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors[J].J Natl Cancer Inst，2000，92（3）：205-216.

[6] Latha T S， Panati K， Gowd D S，et al.Ovarian cancer biology and immunotherapy [J].Int Rev Immunol，2014，33（5）：428-440.

[7] Yigit R， Massuger L F， Figdor C G，et al.Ovarian cancer creates a suppressive microenvironment to escape immune elimination[J].Gynecol Oncol，2010，117（2）：366-372.

[8] Lesterhuis W J，De Vries I， Aarntzen E A，et al.A pilot study on the immunogenicity of dendritic cell vaccination during adjuvant oxaliplatin/capecitabine chemotherapy in colon cancer patients[J].Br J Cancer，2010，103（9）：1415-1421.

[9] Cao X.Immunology in China：the past，present and future[J].Nat Immunol，2008，9（4）：339-3342.

[10] Ghansah T，Vohra N， Kinney K，et al.Dendritic cell immunotherapy combined with gemcitabine chemotherapy enhances survival in a murine model of pancreatic carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother，2013，62（6）：1083-1091.

[11]劉洋，曹雪濤.腫瘤免疫治療和化療的協(xié)同效應(yīng)及其作用機(jī)制[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2014，21（1）：98-103.

[12]徐梅，李丹，蔣敬庭，等.CIK細(xì)胞聯(lián)合紫杉醇對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)[J].腫瘤，2014，34（7）：591-595.

[13] Liu J，Li H，Cao S，et al.Maintenance therapy with autologous cytokine-induced killer cells in patients with advanced epithelial ovarian cancer after first-line treatment[J].J Immunother，2014，37（2）：115-122.

[14]杜鴻昱，周敏.30例卵巢癌患者化療前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，32（12）：48-49.

[15]楊海青，孫偉娜，陳院朝，等.卵巢癌患者外周血CD4+CD25 high Treg細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果與分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（30）：134-135.

[16]夏俊賢，朱美琴，陳敬華，等.晚期卵巢癌CIK治療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的變化及其臨床意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013，34（9）：1383-1385.

[17] Yang L，Ren B，Li H，et al.Enhanced antitumor effects of DC-activated CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non-small-cell lung cancer patients[J].Cancer Immunol Immunother，2013，62（1）：65-73.

[18] Braumüller H，Wieder T，Brenner E，et al.T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence[J].Nature，2013，494（7437）：361-365.