慢病毒載體介導的CXCR 7-shRNA聯合重樓總皂苷對胃癌細胞SGC 7901特異性靶向干預的實驗研究

趙東文 ，李諶 ，王海龍，陸航Δ

（1.遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.瓦房店市中心醫(yī)院 普外科，遼寧 瓦房店 116300；3.遼寧醫(yī)學院 附屬第一醫(yī)院 普外科,遼寧 錦州 121001）

慢病毒載體介導的CXCR 7-shRNA聯合重樓總皂苷對胃癌細胞SGC 7901特異性靶向干預的實驗研究

趙東文1,2，李諶3，王海龍3，陸航3Δ

（1.遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.瓦房店市中心醫(yī)院 普外科，遼寧 瓦房店 116300；3.遼寧醫(yī)學院 附屬第一醫(yī)院 普外科,遼寧 錦州 121001）

目的探討慢病毒介導的CXCR 7-shRNA轉染人胃癌細胞株SGC 7901后重樓總皂苷干預對CXCR7蛋白表達的影響。方法設計并合成CXCR7的3條shRNA序列及1條陰性對照序列，與pSilencerTM 4．1系統(tǒng)合成構建重組慢病毒載體，轉染HEK 293 T細胞包裝病毒并檢測滴度；將3種重組慢病毒載體及陰性對照分別感染人胃癌細胞SGC 7901，RT-PCR檢測用藥前后CXCR 7 mRNA的表達情況，測定沉默效率，篩選沉默效率最高的一組CXCR 7-shRNA作為后續(xù)實驗表達載體；MTT法檢測轉染CXCR 7-shRNA對SGC 7901細胞的增殖的影響以及重樓總皂苷干預后的影響；Western blot檢測轉染CXCR 7-shRNA后SGC 7901細胞蛋白表達情況以及重樓總皂苷干預的影響。結果測序證實3種慢病毒載體及1組陰性對照載體均包裝成功，滴度分別4．9×108pfu/mL、3．6×108pfu/mL、5．2×108pfu/mL和2．0×108pfu/mL；3組慢病毒載體轉染SGC 7901細胞后，CXCR 7 mRNA的表達量均較陰性對照組顯著降低（P＜0．05），其中CXCR 7-shRNA-1組和重樓總皂苷組對CXCR7的抑制率顯著高于其他2組（P＜0．05）；CXCR 7-shRNA-1轉染SGC 7901后，腫瘤細胞的生長增殖下降，與其他組相比有顯著性差異（P＜0．05）；CXCR 7-shRNA-1轉染SGC 7901后，與空病毒載體組、空白組相比，CXCR 7蛋白表達量顯著降低（P＜0．05）。結論成功構建了3種CXCR 7-shRNA慢病毒表達載體。轉染SGC 7901細胞以及采用重樓總皂苷處理均可有效下調CXCR 7 mRNA和蛋白的表達水平，并能夠抑制腫瘤細胞的增殖與侵襲。因此可認為CXCR7基因在該機制中起到了至關重要的作用，為我們進一步研究以CXCR 7/CXCL 12生物學軸為靶點的胃癌基因治療奠定了基礎。

胃癌；CXCR 7；CXCL 12；慢病毒載體；shRNA

胃腸道惡性腫瘤是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率與死亡率均高于世界平均水平，手術切除是目前唯一有效的根治方法，但患者術后的五年生存率依舊在50%，根本沒有明顯的提升[1]。究其原因，很早就發(fā)生的遠處侵襲與局部轉移是影響該病種術后低生存率的最主要因素，這同樣也是影響其他癌癥患者術后低生存率的關鍵因素，并且在當前依舊缺乏更加有效的治療辦法。隨著分子基因診斷與治療技術的發(fā)展，靶向治療成為了抗腫瘤特異性治療的最高層次，從分子水平來阻斷侵襲轉移的基礎和環(huán)境是目前胃癌治療研究的前沿領域[2]。

趨化因子（chemokines）是控制免疫細胞定向向炎癥區(qū)域遷移的一種新的細胞因子[3]。最近的研究表明，chemokines及其受體在一些癌癥細胞的增殖與遠處轉移的過程中處于關鍵的位置[4]。有學者報道，CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）與 CXC 趨化因子 12（CXC chemokine ligand 12，CXCL12）之間的相互作用是胃癌侵襲轉移和增殖的關鍵生物學行為[5]。然而最近的研究表明，在前列腺癌或乳腺癌中僅僅抑制了CXCR4基因的表達活性，只有一部分阻斷了該項癌癥的增殖與遠處轉移，這就說明至少還存在著一些其他的因素控制著這兩種腫瘤的部分增殖和特異性遠處轉移，由此發(fā)現了CXCL12的另外一個趨化因子受體CXCR7（CXC chemokine receptor 7，CXCR7）[6]。通過進一步的研究發(fā)現，CXCR7也可以提高腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移能力[7-8]。在前期研究中，我們發(fā)現在人胃癌組織中可見檢測到大量的CXCR7蛋白的表達，相對于正常組織具有統(tǒng)計學意義，由此可以推測CXCR7可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉移的過程中發(fā)揮重要的生物學作用。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）這項技術是由雙鏈RNA介導的、特異性的轉錄后致使目的基因出現沉默的現象，廣發(fā)用于降低或關閉特定目的基因的表達，為內源性功能基因研究和基因治療提供了新的策略[9]。重組慢病毒載體（lentiviral vector）是最近研發(fā)出的一個新型的真核細胞表達載體，該載體承載的目的基因轉染效率極高，并進一步通過基因整合入細胞基因組，穩(wěn)定且持久的產生小發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）而發(fā)揮其關鍵的基因沉默效應[10]。本文將構建人CXCR7的慢病毒shRNA表達載體，研究將其轉染人胃癌細胞SGC7901后對CXCR7的特異性靶向抑制作用，為后續(xù)的研究胃癌CXCR7靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 pSilencerTM 4.1慢病毒載體系統(tǒng)（購自Invitrogen公司）；HEK 293 T細胞株、胃癌SGC 7901細胞株（購自中科院細胞庫）；細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶等（購自美國Gibco公司）；限制性核酸內切酶、DNA連接酶、小提試劑盒、RT-PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒等（購自TaKaRa公司）；兔抗人CXCR7單克隆抗體、二抗、內參照等（購自Santa Cruz公司）；其他常規(guī)試劑由遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

重樓，產地為四川，購自遼寧正大中藥飲片加工有限公司。將重樓曬干打粉，過二號篩，置于60℃干燥箱中，稱取藥材150 g。加10倍量75%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽濾，濾液進行旋蒸、減壓濃縮干燥得到干燥粉末。將提取物用DMSO溶解后定容至150 mg/mL，并以3000 r/min離心20 min取上清液，采用0.22 μL微孔濾膜，濾液置于4℃冰箱中保存，待用。

1.2 引物設計與合成 根據人GenBank（NM_020311）顯示的人CXCR7序列設計3對shRNA引物及1對對照序列，與美國NCBI數據庫進行序列對照檢索，結果與其他基因序列并無同源性，可以應用；該引物的設計與合成由廣州賽業(yè)生物科技有限公司完成（見表1）。

表1 CXCR 7-shRNA引物序列及陰性對照序列Tab. 1 CXCR 7-shRNA primer sequences and negative control sequence

1.3 CXCR7-shRNA慢病毒表達載體的構建與包裝 首先搭建如下反應體系合成CXCR7-shRNA-1：10×Taq buffer 2 μL，上下游引物各 5μL，Taq DNA聚合酶 1μL，超純水7μL，合成雙鏈oligo片段；根據慢病毒載體系統(tǒng)試劑盒說明，將pSilencerTM 4.1載體線性化后純化回收，與上述構建完成的CXCR 7-shRNA片段連接后轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆后擴增提取DNA片段，線性化后利用Lipofectamine 2000試劑轉染HEK 293T細胞進行慢病毒包裝并進行滴度測定。同理構建另外2組CXCR7-shRNA慢病毒載體及一組陰性對照載體。

1.4 慢病毒表達載體的效率測定 常規(guī)培養(yǎng)胃癌SGC7901細胞，將上述3組實驗病毒液及1組對照病毒液分別以最佳感染指數（MOI=40）轉染后，培養(yǎng)48～72 h，待到細胞發(fā)生細胞病變效應（Cytopathic effect，CPE）后分別抽提出4組細胞總的RNA，按照上述RT-PCR一步法試劑盒說明書進行具體操作，之后鋪1%瓊脂糖進行凝膠電泳，使用BIO-RAD瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)分析各組條帶的光密度值（OD值），重復上述實驗3次。選取沉默效率最高的一組病毒液作為轉染SGC7901的實驗組病毒液。

1.5 轉染慢病毒后以及重樓總皂苷對SGC7901細胞增殖檢測 常規(guī)培養(yǎng)胃癌SGC7901細胞，傳至第三代對數生長期，于96孔板上接種，轉染上述沉默效率最高的慢病毒液（A組），同時選取空白對照（B組），每孔內加入預先配置好的5 mg/mL 的MTT溶液20 μL，調至37℃溫箱孵育4 h，棄上清，每孔中再加入150 μL的二甲基亞砜，輕微震蕩8～10 min使內部結晶能夠充分溶解；置于酶標儀上以490 nm波長測定各孔光吸收值，繪制細胞增殖曲線。

1.6 轉染慢病毒后SGC7901細胞中CXCR7 蛋白表達情況檢測 將沉默效率最高的一組慢病毒液作為A組（實驗組）與B組（空病毒載體組）、C組（重樓總皂苷組）分別轉染第三代SGC7901細胞后培養(yǎng)72 h，提取各組細胞總蛋白并定量；配制8%分離膠與5%濃縮膠，加樣后以60 V，30 min；100 V，1.5 h，進行電泳；轉膜后麗春紅復染，洗脫3次孵育一抗（1∶1000，兔抗人單克隆抗體）4℃過夜；孵育二抗（1∶1500，羊抗兔多克隆抗體）室溫1 h；用BCIP/NBT染色工作液避光室溫孵育3 h，凝膠成像系統(tǒng)分析膜上目的條帶和內參照條帶，重復3次測OD值，計算凈光密度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 8.0對所得的各項數據結果進行統(tǒng)計學處理，其中正態(tài)計量資料采用“±s”來表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CXCR7-shRNA慢病毒載體構建及包裝結果 構建完成的3組慢病毒載體pSilencerTM 4.1-CXCR 7-shRNA及1組陰性對照序列經賽業(yè)公司測序分析顯示并無任何堿基發(fā)生突變，合成的4組序列與預期DNA序列結果相符，由此認為的CXCR 7-shRNA序列插入正確，DNA重組成功，可進行后續(xù)實驗，測序由TaKaRa公司完成。慢病毒包裝系統(tǒng)轉染HEK 293T細胞后48 h，熒光顯微鏡下可見強綠色熒光表達，同時出現CPE現象：細胞觸角回收、腫脹變圓，一部分細胞脫落，懸浮于視野中（見圖1）。病毒滴度測定為：CXCR 7-shRNA-1，4.9×108pfu/mL；CXCR 7-shRNA-2，3.6×108pfu/mL；CXCR7-shRNA-3，5.2×108pfu/mL；陰性對照，2.0×108pfu/mL，均符合慢病毒干擾實驗要求，可進行后續(xù)實驗。

圖1 慢病毒載體轉染HEK 293 T細胞后48 h病毒包裝（×40）Fig.1 Virus package of lentivirus vector transfection into HEK 293 T cell（×40）

2.2 慢病毒載體干擾效率測定結果 RT-PCR結果顯示，SGC 7901細胞轉染CXCR 7-shRNA后，3組實驗組細胞的CXCR 7 mRNA表達相對于空白組（D組）顯著減少（P＜0.05）。其中CXCR 7-shRNA-1轉染組（A組）的CXCR 7 mRNA表達量顯著低于其他2個實驗組（B、C組）（P＜0.05），說明CXCR 7-shRNA-1組對于胃癌細胞SGC 7901的CXCR 7 mRNA的抑制率高于其他2組，因此我們將選擇CXCR 7-shRNA-1作為后續(xù)實驗的實驗組（見圖2）。

圖2 RT-PCR檢測CXCR 7 mRNA的表達A，B，C. 實驗組；D. 空白組*P＜0.05，與D 組相比；﹟P＜0.05，與A 組相比Fig.2 CXCR 7 mRNA expression detected by RT-PCRA，B，C. experiment groups；D. blank group*P＜0.05， compared with group D；﹟P＜0.05， compared with group A

2.3 轉染慢病毒后SGC 7901細胞增殖檢測結果 2組SGC 7901細胞分別在培養(yǎng)24、48、72、96及120 h后通過MTT方法檢測細胞光密度值（OD值），并根據檢測出的OD值繪制了細胞生長增殖曲線，結果顯示，未轉染病毒組（B組）細胞生長迅速，實驗組（A組）經病毒轉染后細胞增殖程度顯著減少，與B組相比從第24 h開始各個時間段均具有顯著性差異（P＜0.05），說明慢病毒載體CXCR 7-shRNA抑制CXCR7基因表達后可抑制胃癌細胞SGC 7901的增殖（見圖3）。

圖3 轉染病毒后各時間段SGC 7901細胞增殖的生長曲線Fig.3 SGC 7901 cell proliferation and growth curve*P＜0.05，與A 組相比*P＜0.05， compared with group A

2.4 轉染慢病毒后SGC 7901細胞CXCR7蛋白表達結果由Western blot檢測結果可知，空病毒載體組（B組）與空白組（C組）CXCR7蛋白表達量顯著高于實驗組（A組）（P＜0.05），而B、C 2組之間相比無顯著性差異（見圖4）。

圖4 Western blot檢測CXCR7蛋白的表達結果A. 實驗組；B. 空載組；C. 空白組*P＜0.05，與A 組相比Fig.4 CXCR 7 protein expression detected by Western blot A. experiment group； B. empty vector group； C. blank group*P＜0.05， compared with group A

3 討論

中藥重樓為百合科植物七葉一枝花或者云南重樓的干燥根莖，該藥具有消腫止痛、清熱解毒的效果，主要用于咽喉腫痛、驚風抽搐等癥。目前，已經有很多文獻報道該藥具有抑制腫瘤生長的作用[11]。本實驗也證實了重樓總皂苷對感染后SGC7901具有一定的抑制作用。

惡性腫瘤的生長和轉移是一個極其復雜的過程。癌細胞異?；钴S性增殖和局部、遠處的侵襲轉移是目前胃癌進一步發(fā)生發(fā)展的重要步驟，其機制中的很多激活因子當前可以用來做為靶向藥物治療的研究目標之一[12]。趨化因子及其受體參與了多種腫瘤的異?；钴S性增殖和遠處侵襲轉移，尤其是CXCL12及CXCR4或CXCR7在這一機制中起到了關鍵的作用。CXCR7是最近才發(fā)現的與CXCL12具有高度親和性的受體，與前面發(fā)現的CXCR4具有類似的作用[13]。研究表明，被激活的CXCR7可以極大的提高腫瘤細胞的異常增殖、粘附和遠處侵襲轉移的能力[14]。有學者報道，在高侵襲性的前列腺癌組織中發(fā)現CXCR7的表達極大的上調，而通過使用CXCR7因子拮抗劑之后也可以抑制乳腺癌與肺癌的生長和轉移[15-16]。

shRNA是具有緊密發(fā)卡環(huán)結構的小RNA序列，常被用于通過特異性沉默靶基因表達的RNAi實驗[17-18]。本項研究廣泛的參考了shRNA轉染的各項特點，例如成本低廉，轉染持久性強及轉染后基因穩(wěn)定性好等，由此選擇構建重組慢病毒介導的shRNA進行實驗。慢病毒表達載體CXCR7-shRNA成功構建后，以載體中含有的GFP作為示蹤因子，在包裝成功后可以很方便的通過綠色熒光追蹤檢測。結果顯示，3組實驗組慢病毒載體與對照組在熒光顯微鏡下均出現了大量的綠色熒光表達且面積廣泛，表明攜帶有GFP的各組慢病毒表達載體成功包裝，轉染效率可達80%以上。

本實驗的RT-PCR檢測結果說明，實驗組的3種重組慢病毒載體CXCR7-shRNA轉染至胃癌SGC7901細胞后，CXCR7的mRNA的表達量呈現出不同程度的降低，與陰性對照組相比具有顯著性差異，由此說明各實驗組成功轉染到SGC7901細胞，并成功抑制了該細胞中的CXCR7基因的進一步表達。而陰性對照組中的CXCR7 mRNA表達沒有明顯的降低。從3個實驗組的CXCR7 mRNA表達量被抑制的情況來看，A組的抑制效果比其他2組更好，相比具有顯著性差異，說明1組的沉默效應是3組中最有效的，便于后續(xù)進行干擾沉默檢測。

對胃癌細胞SGC7901增殖抑制方面，我們發(fā)現在轉染病毒后的24 h、48 h、72 h、96 h、120 h這 5個時間段內，未轉染病毒組細胞生長迅速，呈對數上升趨勢，而將實驗組轉染該細胞后腫瘤細胞的增殖程度呈明顯抑制的趨勢，與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這說明實驗組慢病毒液通過抑制腫瘤細胞中的CXCR7基因表達后可進一步抑制該細胞的增殖，也進一步證明了CXCR7/CXCL12生物學軸在胃癌細胞的生長增殖過程中起到了重要的作用。

對于轉染病毒后胃癌細胞中CXCR7蛋白表達檢測結果來說，Western blot實驗證實，實驗組轉染至胃癌細胞SGC7901后，可以使細胞中的CXCR7蛋白表達量降低，相對于空病毒載體組和空白組有明顯的統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而空病毒載體組和空白組比較，2組中的CXCR7蛋白表達量均沒有發(fā)生明顯的變化，2者相比差異無統(tǒng)計學意義。以上結果說明，本實驗不僅成功的將小片段的干擾shRNA轉染至SGC7901細胞，并且還成功的抑制了SGC7901細胞內CXCR7的蛋白的表達，由此可以進一步推斷出CXCR7基因在胃癌細胞的生長增殖與遠處侵襲轉移的機制中可能發(fā)揮極其重要的作用，為進一步研究以CXCR7/CXCL12生物學軸為靶點的胃癌基因治療奠定基礎。

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Speci fi c targeted-intervention effect of CXCR 7-shRNA mediated by low viral carrier plus Rhizoma Paridis total saponin on tumor cells: an experimental study

ZHAO Dong-wen1,2, LI Chen3, WANG Hai-long3, LU Hang3Δ

(1.Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Department of general surgery, Hospital of Wafangdian City Central, Wafangdian 116300, China; 3.Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the CXCR 7 protein expression when CXCR 7-shRNA transfected into human gastric cancer cell which mediated with lentivirus vector combined with Rhizoma Paridis Total Saponin.MethodsThree shRNA sequences of CXCR 7 and one negative control sequence were designed and synthesized, and recombinant lentiviral vectors with pSilencerTM 4.1 system were established. Transfection of HEK 293 T cells and packaging viral were finished and the titers were detected. Transfection of all recombinant lentiviral vectors and negative control vector were finished and expression of CXCR 7 mRNA were detected by RT-PCR method. Silence efficiency in groups were determined and the expression vector with highest silence efficiency was selected for next experiments. To detect the effect of SGC 7901 cell proliferation by CXCR 7-shRNA transfection and combined with Rhizoma Paridis Total Saponin intervention with MTT. To detect the effect of SGC 7901 cell expression of protein by CXCR 7-shRNA transfection and combined with Rhizoma Paridis Total Saponin intervention with Western blot.ResultsThe packaging of three lentiviral vector and negative control sequence are successful which is confirmed by gene sequencing and the titer are 4.9×108pfu/mL, 3.6×108pfu/mL, 5.2×108pfu/mL,2.0×108pfu/mL respective. The expression quantity of CXCR 7 mRNA in positive groups are lower than negative control group（P＜0.05） and inhibition ratio to CXCR 7 in CXCR 7-shRNA-1 and combined with Rhizoma Paridis Total Saponin intervention group is higher than the other two groups（P＜0.05）.The proliferation level of tumour cell is significant reduction after CXCR 7-shRNA-1 transfection and have a significant difference comparing to the group without transfection（P＜0.05）. The expression of CXCR 7 protein is significant reduction after CXCR 7-shRNA-1 transfection comparing to the group without virus vector and negative control group and have a significant difference（P＜0.05）.ConclusionThe construction of three CXCR 7-shRNA lentiviral expression vector are successful and expression level of protein and CXCR 7 mRNA are down-regulated effectively after transfection and combined with Rhizoma Paridis Total Saponin intervention. It maybe means that CXCR 7 gene takes an important role in the process of gastric cancer proliferation and invasion.This is foundation for further study of gastric cancer gene therapy using CXCR 7/CXCL 12 biological axis as a target.

gastric cancer; CXCR 7; CXCL 12; lentivirus vector; shRNA

R 735．2

A

1005-1678(2014)02-0022-04

遼寧省自然科學基金資助項目（201102124）

趙東文，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：胃癌發(fā)病機制與防治，E-mail：zdw 9876@163.com；陸航，通信作者,男，博士，副教授，研究方向：消化道上皮來源腫瘤的發(fā)生機制及診治，E-mail：jzahang@163.com。