m ir-518d在妊娠期糖尿病患者胎盤中的表達及意義

常玉華，劉香壞，李坤

（1.山東省交通醫(yī)院 婦產科，山東 濟南 250031；2.山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院 婦產科，山東 濟南 250031）

m ir-518d在妊娠期糖尿病患者胎盤中的表達及意義

常玉華1，劉香壞1，李坤2

（1.山東省交通醫(yī)院 婦產科，山東 濟南 250031；2.山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院 婦產科，山東 濟南 250031）

目的探討mir-518d在妊娠期糖尿病（gestational diabetesmellitus，GDM）患者胎盤中的表達及意義。方法選擇山東省交通醫(yī)院2013年1月～2013年12月間收治的行剖宮產分娩的GDM產婦30例作為GDM組，同期行剖宮產的正常產婦30例作為對照組。應用實時定量PCR檢測胎盤和血清mir-518d的表達；應用ELISA法檢測血清雌二醇水平；應用電化學發(fā)光法檢測血清胰島素水平。結果GDM組孕婦血清及胎盤mir-518d表達水平均顯著高于對照組（P＜0.01）。應用Targetscan和miRanda基因預測軟件發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物活受體a（peroxisome proliferator activated receptor A，PPARa）基因存在1個mir-518d結合位點，推測PPARa是mir-518d的靶基因。GDM組孕婦血清雌二醇水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清胰島素水平顯著低于對照組（P＜0.01）。Pearson相關性分析顯示，胎盤mir-518d的表達水平與血清雌二醇水平呈正相關（r＝0.686，P＝0.012），與血清胰島素水平呈負相關（r＝－0.554，P＝0.020）。結論mir-518d可能通過調控PPARa基因影響機體糖代謝過程，在GDM發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

mir-518d；過氧化物酶體增殖物活受體a；妊娠期糖尿病

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇山東省交通醫(yī)院2013年1月～2013年12月間收治的行剖宮產分娩的GDM產婦30例作為GDM組，診斷標準參照《婦產科學》第7版中GDM診斷標準［5］。年齡22～37歲，平均（28.1±3.2）歲，孕周36～42周，平均（38.4±0.8）周。選取同期行剖宮產的正常產婦30例作為對照組，年齡22～36歲，平均（27.7±3.2）歲，孕周36～42周，平均（38.8±0.7）周。所有受試者均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病病史，并對實驗研究知情同意，研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要實驗試劑與儀器 RNAiso for Small RNA試劑盒購自日本TaKaR；mirNeasy kit購自德國Qiagen；Trizol試劑購自美國Invirogen；逆轉錄試劑盒、Taqman檢測試劑盒、mir-518d特異性檢測引物購自美國Applied Biosystem Inc。人雌激素酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，購自上海逸峰有限公司。主要實驗儀器：Cobas e411電化學發(fā)光法胰島素檢測儀（Beckman公司，美國），BH13MD1600全自動生化分析儀（Beckman公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及處理：在剖宮產后分別采集胎盤母體面中央處1 cm×1 cm×1 cm組織塊，用干紗布吸干水分后液氮速凍低溫保持。同時抽取孕婦外周靜脈血10m L，5 000 r／min離心10min，取上清液放置－80℃冰箱中保存。

1.3.2 樣品RNA提?。杭羧?00mg左右胎盤組織，加液氮研磨至粉末狀，應用RNAiso for Small RNA進行提取，嚴格按照說明書步驟進行操作，最后加入50μL無RNA酶水解RNA，取1μL樣品應用分光光度計測量RNA濃度，并將RNA溶液置于－80℃保存。取100μL血清，加入3倍體積 TRIzol室溫放置15min，然后加入等體積氯仿，震蕩50 s，室溫放置15min，4℃下14 000 r／min高速離心，將水相轉移15mL離心管中，加入1.5倍體積的無水乙醇，充分混勻后應用mirNeasy kit富集RNA，最后加入50μL無RNA酶水解RNA，取1μL樣品應用分光光度計測量RNA濃度，并將RNA溶液置于－80℃保存。

1.3.3 實時定量PCR檢測：應用TaqMan microRNA探針試劑和ABI7500熒光定量PCR儀進行逆轉錄和PCR擴增，先進行RNA逆轉錄獲得 cDNA：16℃孵育30 min，42℃反應30 min，85℃孵育5min，獲得cDNA。然后進行q-PCR反應：95℃循環(huán)5 min；95℃、15s，60℃、1min進行45個循環(huán)。mir-518d上游引物為5’-ACACTCCGGGCAAAGCGCTTCCCTT-3’，下游引物為 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGCTCCAAA-3’，以U6作為內參。

1.3.4 PCR產物的檢測：取PCR產物4μL加入1μL Buffer上樣，電泳液用1×TBE，150 V電泳60min，紫外透射儀下觀察PCR產物，個體 miRNAs表達水平以 2-ΔCt表示，ΔCt＝Ct樣本-CtU6。

1.3.5 血清雌二醇及胰島素檢測：取血清2 mL，應用ELISA法檢測血清雌二醇水平；另取血清2mL，應用電化學發(fā)光法檢測血清胰島素水平。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有實驗結果均重復3次，用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量數據用“±s”表示，計數資料比較應用t檢驗，應用Pearson相關性分析進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組孕婦一般資料比較 2組孕婦年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計學意義；GDM組孕婦BMI、新生兒體質量及胎盤重量顯著高于對照組（P＜0.05，見表1）。

表1 2組孕婦一般資料比較Tab.1 Comparison of the basic data of pregnantwomen between two groups

2.2 2組孕婦血清及胎盤mir-518d表達結果 GDM組孕婦血清及胎盤mir-518d表達水平均顯著高于對照組（P＜0.01，見表2）。

表2 2組孕婦血清及胎盤mir-518d的表達結果Tab.2 Expressions of serum and placentamir-518d of pregnantwomen in two groups

2.3 生物信息學預測mir-518d靶基因 應用Targetscan和miRanda基因預測軟件發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物活受體a（PPARa）基因存在1個mir-518d的結合位點，推測PPARa是mir-518d的靶基因（見圖1）。

圖1 mir－518d與PPARa基因結合模擬圖Fig.1 The simulation figure ofmir－518d and PPARa gene combination

2.4 2組孕婦血清雌二醇及胰島素水平比較 GDM組孕婦血清雌二醇水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清胰島素水平顯著低于對照組（P＜0.01，見表3）。

表3 2組孕婦血清雌二醇及胰島素水平比較Tab.3 Camparison of serum estradiol and insulin levels of pregnantwomen in two groups

2.5 相關性分析 Pearson相關性分析顯示，胎盤mir-518 d的表達水平與血清雌二醇水平呈正相關（r＝0.686，P＝0.012），與血清胰島素水平呈負相關（r＝－0.554，P＝0.020）。

3 討論

GDM是一種發(fā)病機制及其復雜的疾病，目前其病因和發(fā)病機制仍未完全明確。大量研究表明，GDM發(fā)病可能與遺傳、免疫等因素有關［6-8］。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，基因在GDM發(fā)病中的作用得到了人們的廣泛關注，成為GDM的研究熱點之一。miRNAs具有調節(jié)生物體生長、發(fā)育以及疾病發(fā)生中基因表達的功能［9］。已有研究證實miRNAs與糖尿病、妊娠期高血壓疾病等的發(fā)病密切相關。Shi Z等［10］研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型大鼠應用雷米普利后出現(xiàn)多個miRNA表達差異，其中mir-518d可能通過轉錄水平參與胰腺功能調解。然而目前尚無妊娠期糖尿病孕婦胎盤中mir-518d表達的研究［11］。

本研究通過real-time PCR對GDM和正常孕婦胎盤及血清中mir-518d表達的檢測發(fā)現(xiàn)：GDM組孕婦血清及胎盤mir-518d表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。提示mir-518d可能在GDM發(fā)病中起到重要的作用。應用Targetscan和miRanda基因預測軟件進一步分析顯示，PPARa基因存在1個mir-518d結合位點，推測PPARa是mir-518d靶基因。有研究報道，PPARa具有增強機體對胰島素的敏感性，調節(jié)體內糖代謝等生物學功能［12］。另有研究報道 GDM胎盤中存在 PPARa的低表達［13］。因此筆者推測，mir-518d可能通過與PPARa的結合降低機體對胰島素的敏感性，從而降低機體調節(jié)糖代謝的能力。

本研究還對2組孕婦血清雌二醇及胰島素水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)GDM組孕婦血清雌二醇水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清胰島素水平顯著低于對照組（P＜0.05）。而Pearson相關性分析顯示，胎盤mir-518d的表達水平與血清雌二醇水平呈正相關（r＝0.686，P＝0.012），與血清胰島素水平呈負相關（r＝－0.554，P＝0.020）。進一步提示mir-518 d可能通過某些信號轉導通路促進孕婦雌二醇分泌，降低胰島素分泌，從而影響GDM發(fā)病，其具體機制還有待于進一步研究。

綜上所述，mir-518d可能通過調控PPARa基因影響機體糖代謝過程，在GDM發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，而這一過程中伴隨雌二醇及胰島素的變化，對研究GDM的發(fā)病機制有重要意義。

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（編校：吳茜）

M ir-518d expression in placenta during pregnancy w ith diabetic patients and its significance

CHANG Yu-hua1，LIU Xiang-huan1，LIKun2

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shandong Traffic Hospital，Ji'nan 250031，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences，Ji'nan 250031，China）

ObjectiveTo study the expression of mir-518d in placenta of pregnancy and mechanism in gestational diabetes mellitus（GDM）patients.Methods30 cases of GDM in Shandong Traffic Hospital from January 2013 to December 2013 who underwent cesarean delivery were selected as GDM group，30 cases of normal parturients underwent cesarean section as control group.Serum expressions ofmicro RNA-518 d were tested by realtime quantitative PCR， serum estradiol levels were detected by ELISA， and serum insulin level were detected by electrochemiluminescence.ResultsExpression ofmaternal serum and placentalmir-518d in GDM group were significantly higher than those in control group（P＜0.01）.Peroxisome proliferator activated receptor A（PPARa）gene had a mir-518d binding site predicted by Targetscan and miRanda gene prediction software.Pregnantwomen serum estradiol level of GDM group was significantly higher than that of control group（P＜0.05），serum insulin level was significantly lower than thatof control group（P＜0.01）.Pearson correlation analysis results showed that placentamir-518d levelwas positively related to serum estradiol level（r＝0.686，P＝0.012），and negatively correlated with serum insulin level（r＝－0.554，P＝0.020）.ConclusionMir-518 d may affect glucosemetabolism in the body process through regulating PPARa gene，and it plays an important role in the development of GDM.

mir-518d；peroxisome proliferator activated receptor A；gestational diabetesmellitus

R71

A

1005－1678（2014）05－0085－03

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖代謝異常，是產科常見的并發(fā)癥，約占全部妊娠的5%～6%［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，GDM可以增加妊娠期高血壓、自然流產、羊水過多等發(fā)生率，對母嬰結局產生負面影響，臨床應給予重視［2］。目前，對于GDM病因和發(fā)病機制仍未完全明確，研究GDM的發(fā)病機制，對于尋找新的診斷治療方法具有重要的臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長19～23nt的非編碼RNA分子，已有研究證實其與糖尿病、妊娠期高血壓等的發(fā)病密切相關［3］。其中mir-518d家族位于人類19q染色體上，它隨著妊娠的進展在母體中表達水平逐漸增高，與GDM發(fā)病可能有重要關系［4］。本文旨在探討mir-518d在GDM患者胎盤中的表達及其作用機制。

山東省自然科學基金（ZR2009CL027）；濟南市科技局科技明星計劃（20100118）；山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學基金（201023）

常玉華，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：婦產科學，E-mail：13969106788＠139.com。