茶多酚聯(lián)合萊菔硫烷對肺癌組織蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2表達(dá)的影響

玄菲，徐芳

（1.山東省萊蕪市人民醫(yī)院 腫瘤科，山東 萊蕪 271100；2.濱州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濱州 256603）

茶多酚聯(lián)合萊菔硫烷對肺癌組織蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2表達(dá)的影響

玄菲1，徐芳2

（1.山東省萊蕪市人民醫(yī)院 腫瘤科，山東 萊蕪 271100；2.濱州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濱州 256603）

目的探討茶多酚聯(lián)合萊菔硫烷對肺癌組織中蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2表達(dá)的影響。方法選取經(jīng)病理證實(shí)并手術(shù)治療的肺癌患者56例，隨機(jī)分為聯(lián)合給藥組和對照組，每組28例。采用ELISA測定所有患者肺組織中蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2的含量；免疫組化SP法測定組織中蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)并統(tǒng)計(jì)微血管密度（microvascular density，MVD）；Western Blot檢測組織中蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果

對照組肺癌患者組織中蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2的含量均高于聯(lián)合給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；免疫組化SP法結(jié)果顯示肺癌患者癌變組織中蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)均呈陽性表達(dá)，且對照組織中MVD高于聯(lián)合給藥組（P＜0.01）；Western Blot結(jié)果顯示對照組組織中蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2蛋白表達(dá)高于聯(lián)合給藥組（P＜0.01）。結(jié)論蛋白激酶A錨定蛋白95及細(xì)胞周期蛋白E2在肺癌患者組織中均存在表達(dá)升高現(xiàn)象，2者表達(dá)呈正相關(guān)，與藥物治療呈負(fù)相關(guān)，可以作為肺癌的評估檢測指標(biāo)。

蛋白激酶A錨定蛋白95；細(xì)胞周期蛋白E2；肺癌

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中的有效成分，現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料報(bào)道茶多酚對肝癌、艾氏腹水癌等腫瘤都具有抗腫瘤效果［3-4］。茶多酚對腫瘤的治療體現(xiàn)在每個(gè)階段：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、阻遏細(xì)胞傳導(dǎo)通路、阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、抑制端粒酶活性、抑制血管形成等［5］。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是十字花科植物中的成分，可以抑制化學(xué)物誘發(fā)腫瘤的起始階段，對腫瘤有抑制作用［6］。近年的研究表明癌癥的病變過程中，蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2起著相當(dāng)重要的作用［7-9］。目前對于萊菔硫烷聯(lián)合茶多酚治療肺癌的研究報(bào)道較少，尤其是2者合用后對于肺癌組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)也鮮有研究。故本研究旨在探討萊菔硫烷聯(lián)合茶多酚對肺癌組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2的影響，以期為臨床用藥提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年11月～2013年8月山東省萊蕪市人民醫(yī)院腫瘤科收治的56例肺癌患者作為研究對象，均經(jīng)病理證實(shí)且經(jīng)過癌癥組織切除手術(shù)的，隨機(jī)分成對照組和給藥組，每組28例。對照組患者平均年齡（67.2±7.9）歲，癌癥分型：12例為管內(nèi)型肺癌患者；結(jié)節(jié)型患者為3例；管壁浸潤型患者為4例；塊狀型患者為7例；彌漫浸潤性患者為2例。聯(lián)合給藥組平均年齡（68.1±7.4）歲，癌癥分型：14例為管內(nèi)型肺癌患者；結(jié)節(jié)型患者為4例；管壁浸潤型患者為2例；塊狀型患者為5例；彌漫浸潤性患者為3例。2組患者的年齡以及癌癥分型經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)據(jù)具有可比性。

1.2 治療方法 聯(lián)合給藥組患者給予茶多酚（安徽省歙縣茶葉生物堿廠，批準(zhǔn)文號：皖衛(wèi)食準(zhǔn)號2009第137號），結(jié)合說明書，每天2次，每次2粒，連續(xù)服用2周期）和萊菔硫烷（上海譜振生物科技有限公司）聯(lián)合治療；對照組前期不用藥物治療，給予正常的護(hù)理。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 Western Blot檢測2組患者蛋白激酶A錨定蛋白95受體（AKAP-8）和細(xì)胞周期蛋白E2受體的表達(dá)：取肺癌患者經(jīng)手術(shù)切除后留下的鮮活肺部組織，液氮研磨使細(xì)胞破裂充分，將已經(jīng)破碎的組織裝入混勻器中進(jìn)行混勻，按100μL／10ng加入含PMSF的裂解液，冰上孵育30min，低溫12 000 r／min離心5min，取上清，－80℃凍存?zhèn)溆??？偟鞍撞捎每捡R斯亮藍(lán)進(jìn)行定量。組織樣品加入0.25倍量5×SDS上樣緩沖液進(jìn)行混勻，煮沸6min左右變性，用10%SDS-PAGE 115 V電泳，210mA恒流1 h 40min濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉3 h，分別添加抗蛋白激酶A錨定蛋白95受體（AKAP-8）和細(xì)胞周期蛋白E2受體單抗（鼠抗人1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10min，最后采用發(fā)光試劑盒ECL反應(yīng)，X膠片曝光顯影。

1.3.2 ELISA檢測2組患者肺組織中蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2含量：取患者新鮮肺癌組織，勻漿，低溫3 000 r／min離心15min，取上清液置于－40℃保存待測。選用雙抗體ELISA法測定蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2含量，試劑盒購于美國RnD公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)采用吸光度值計(jì)算濃度（pg／mL）表示。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測2組患者肺組織微血管密度（MVD）：取患者肺癌變鮮活組織，浸泡在4%甲醛中固定，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片。采用鏈霉菌抗生素蛋白過氧化物酶測定，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行。用已知的蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2肺癌組織做陽性對照，陰性對照組采用的是PBS作為一抗進(jìn)行孵化，鼠抗人以及顯色劑等均購自與北京中杉生物科技有限公司。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)參考文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)MVD在肺癌組織中情況［10］：組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2含量的測定采用的是灰度值掃描，通過與β-actin進(jìn)行比較得出灰度值比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別采用SPSS 17.0和ImageJ 4.2對數(shù)據(jù)和圖片進(jìn)行處理。正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者肺組織中蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2含量比較 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：給藥組患者蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2的含量均顯著高于對照組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 2組患者肺組織蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2含量比較（pg／mL）Tab.1 Comparision of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 levels between two anchoring（pg／mL）

2.2 組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2表達(dá)與血管關(guān)系 對照組肺癌患者病變組織中蛋白激酶A錨定蛋白95（67.0%）表達(dá)顯著高于聯(lián)合給藥組（24.2%），2者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；細(xì)胞周期蛋白E2（56.5%）也顯著高于聯(lián)合給藥組（22.7%，P＜0.05）。在進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)中，對照組肺癌患者病變組織中以蛋白激酶A錨定蛋白95標(biāo)記的MVD高于聯(lián)合給藥組（P＜0.01），對照組肺癌患者在病變組織中以細(xì)胞周期蛋白E2標(biāo)記的MVD高于聯(lián)合給藥組織（P＜0.01，見圖1、表 2）。

圖1 免疫組化檢測組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2表達(dá)情況Fig.1 Expression of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in two groups by inmmunohistochemical detection

表2 各組組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2表達(dá)與血管的關(guān)系的比較Tab.2 Comparision of the relationship between protein A kinase anchoring protein 95 and cyclin E2 expression and vascular in two groups

2.3 2組患者蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2蛋白表達(dá)水平比較 Western Blot結(jié)果顯示：給藥組患者肺組織蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2蛋白表達(dá)均顯著少于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 2組蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2的蛋白表達(dá)比較*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較Fig.2 Comparision of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 protein expression in two groups*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2為考察指標(biāo)評價(jià)茶多酚聯(lián)合萊菔硫烷對肺癌患者的治療作用。目前的研究僅僅限于單一藥物治療肺癌。茶多酚在治療惡性腫瘤方面的效果逐漸受到重視，而萊菔硫烷也被證實(shí)對于肺癌的治療有一定的效果，目前2種藥物聯(lián)合使用用于肺癌手術(shù)后期治療的研究很少。在本研究中，發(fā)現(xiàn)2種藥物聯(lián)合能下調(diào)肺癌組織蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示聯(lián)合給藥組微血管密度（MVD）低于對照組，說明腫瘤組織生長受到了抑制，2種藥物有抗腫瘤的效果。聯(lián)合給藥組的蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)均低于對照組，說明蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)與腫瘤的生長呈正相關(guān)。

周期蛋白E2是細(xì)胞核內(nèi)蛋白，位于8號染色體 q 22.1。mRNA大小為2.8 kb，由404個(gè)aa組成，相對分子質(zhì)量是4.7×107KDa。周期蛋白E2和周期蛋白E1有47%的同源性，均擁有1個(gè)周期蛋白盒基序［11］。這個(gè)基序是所有的細(xì)胞周期蛋白所共同擁有的。AKAP 95一開始被認(rèn)為是一種AKAP，它能夠?qū)KA特異地錨定于細(xì)胞核內(nèi)的作用［12］。最近發(fā)現(xiàn)AKAP95不僅僅是一種錨定蛋白，它還參與細(xì)胞內(nèi)許多生命過程，如細(xì)胞分裂染色體集縮的建立以及集縮狀態(tài)的維持［13］，DNA復(fù)制和維持mRNA的穩(wěn)定、以及基因表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡以及參與細(xì)胞周期調(diào)控［14-15］等。

本研究并沒有考察茶多酚或者萊菔硫烷單獨(dú)使用對于肺癌的治療效果，主要是由于在前期的研究中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用其中1種藥物，患者在癌癥切除手術(shù)后生存時(shí)間以及對藥物的敏感性并不是很高，處于以治療為主，實(shí)驗(yàn)中未設(shè)置單獨(dú)使用藥物組。下一步的研究將跟蹤隨訪藥物治療后患者的生存情況以及藥物敏感性。蛋白激酶A錨定蛋白95和細(xì)胞周期蛋白E2的高表達(dá)在癌癥患者診斷以及預(yù)后中是否具有參考價(jià)值，還需進(jìn)一步研究。此外，是否可以通過檢測患者血漿中相關(guān)蛋白從而更好對癌癥以及預(yù)后進(jìn)行評價(jià)，也是比較重要的問題。

綜上所述，本研究茶多酚聯(lián)合萊菔硫烷對于癌癥患者組織中蛋白激酶A錨定蛋白95、細(xì)胞周期蛋白E2具有明顯的抑制作用，為預(yù)防和臨床治療癌癥的發(fā)生提供了理論依據(jù)。

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（編校：吳茜）

Effect of tea polyphenols and sulforaphane on the expression of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in lung cancer tissue

XUAN Fei1，XU Fang2

（1.Department of Oncology，Laiwu City People's Hospital，Laiwu 271100，China；2.Basic Medical College，Binzhou Medical College，Binzhou 256603，China）

ObjectiveTo investigate the effect of tea polyphenols and sulforaphane on the expression of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in lung cancer tissue.Methods56 cases confirmed by pathology and operation therapy for lung cancer patients，were randomly divided into combined treatment group and control group，each had 28 cases.The content of protein kinase A anchoring protein 95 and cell cycle protein E2 in all patientswere determined with ELISA.The expression of protein kinase A anchoring protein 95，cyclin E2 and statistics ofmicrovessel density（MVD）were detected by immunohistochemical SPmethod.The protein levels of protein kinase A anchoring protein 95 and cell cycle protein E2 protein were detected by Western Blot.ResultsThe contents of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in control group were higher than that in combination group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Immunohistochemical SP results showed that protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 expression all had positive expression，and the MVD in control group was higher than combination group（P＜0.01）；Western Blot results showed that the expressions of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 protein in control group were higher than combination group（P＜0.01）.ConclusionProtein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 expressions are increased in both groups in lung cancer tissues，and they are positively correlated，negatively correlated with drug treatment，which can be used as the indexes of lung cancer evaluation.

protein A kinase anchoring protein 95；cyclin E2；lung cancer

R730

A

1005－1678（2014）04－0073－03

肺癌是世界范圍內(nèi)的一種常見的發(fā)病率非常高的惡性腫瘤，而且具有非常高的死亡率［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常見的類型，占80%以上。因?yàn)闆]有明顯的初期癥狀及按期的體檢，大部分患者都是在晚期時(shí)才被確診，這就導(dǎo)致會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，錯過了臨床上手術(shù)治療的最佳時(shí)間。到目前為止在臨床治療非小細(xì)胞肺癌的手段主要包括：化療、放療、物理治療、分子靶向治療等手段［2］。

山東省高校科技計(jì)劃（J11LF83）

玄菲，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤內(nèi)科，E-mail：xuanfeilw＠126.com。