轉(zhuǎn)鐵蛋白與R8共修飾脂質(zhì)體的制備及其肝癌靶向性研究

韓立杰，劉偉，杜娟，魏冬冬

（滄州市中心醫(yī)院 放療科，河北 滄州 061001）

轉(zhuǎn)鐵蛋白與R8共修飾脂質(zhì)體的制備及其肝癌靶向性研究

韓立杰，劉偉Δ，杜娟，魏冬冬

（滄州市中心醫(yī)院 放療科，河北 滄州 061001）

目的制備轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）和八聚精氨酸（R8）共修飾脂質(zhì)體（TF／R8-LP），對其理化性質(zhì)進行表征，研究脂質(zhì)體對腫瘤細胞的靶向性。方法采用薄膜分散法制備TF／R8-LP，研究脂質(zhì)體的粒徑，電位和血清穩(wěn)定性。細胞攝取實驗研究肝癌HepG2細胞對TF／R8-LP的攝取效率。構(gòu)建裸鼠肝癌異位瘤模型，研究脂質(zhì)體的體內(nèi)靶向性。結(jié)果TF／R8-LP的粒徑在（108.5±12.6）nm，電位為（24.15±4.78）mV。TF／R8-LP在50%血清中具有良好的穩(wěn)定性。細胞攝取實驗結(jié)果顯示：TF／R8-LP在4 h攝取效率是2 h的1.85倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肝癌HepG2細胞在與脂質(zhì)體共同孵育4 h后對TF／R8-LP的攝取效率分別是R8-LP、TF-LP和LP的2.4倍、2.8倍和3.9倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；近紅外活體成像實驗結(jié)果顯示：TF／R8-LP組在腫瘤組織熒光明顯強于其他組。結(jié)論轉(zhuǎn)鐵蛋白和八聚精氨酸共修飾脂質(zhì)體具有良好的肝癌細胞親和力，是一種潛在高效的肝癌靶向給藥系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白；八聚精氨酸；腫瘤靶向

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人源HepG2肝癌細胞（購自ATCC）。SizerNano ZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司）；膽固醇（Chol，成都科龍公司）；DSPE-PEG3500（美國 Avanti polar lipids）；FITC標記磷脂（美國sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（美國GIBCO公司）；其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞的培養(yǎng)：將HepG2細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細胞匯合度為0.8～0.9時，用0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 RGD／R8-LP-PTX的制備及其表征：參照文獻方法［11］合成DSPE-PEG2000-R8。使用薄膜分散法制備TF／R8-LP。將處方量的 SPC，Cho，DSPE-PEG2000-R8，DSPE-PEG-OMe［保證總磷脂∶膽固醇 ＝70∶30（molar ratio）］，分別溶于氯仿，置50mL茄形瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后，再置真空干燥器中過夜。加入2.5mL PBS緩沖液（pH7.4），置空氣浴搖床中，37℃，180 r／min，20min水化，水浴超聲5 min脫膜，探頭超聲制備得到R8修飾脂質(zhì)體。用后插入法［12］制備TF／R8-LP。首先將轉(zhuǎn)鐵蛋白巰基化，再與商品化的DSPE-PEG3500-MAL孵育得到轉(zhuǎn)鐵蛋白膠束，將膠束后插入已經(jīng)制備的R8-LP得到TF／R8-LP。用FITC標記的磷脂取代適量的大豆磷脂，制備得到FITC標記的脂質(zhì)體，取適量制備得到的脂質(zhì)體樣品，用激光粒度儀測定其粒徑和電位。

取各組樣品500μL，分別與等體積的磷酸鹽緩沖液、含50%FBS的磷酸鹽緩沖液混合，于37℃下分別孵育1、4、8、12、24 h，測定其在750 nm的透光率。以樣品在磷酸鹽緩沖液中的透光率值為空白，以樣品在含有50%FBS的磷酸鹽緩沖液中的透光率與其在磷酸鹽緩沖液中的透光率的比值來評價脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性。

1.2.3 HepG2肝癌細胞對TF／R8-LP的攝?。簩?shù)生長期的細胞以5×105個／孔的密度接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量 FITC標記的 LP、R8-LP、TF-LP和 TF／R8-LP，使孔中FITC標記的磷脂濃度為0.35μg／mL，37℃分別孵育2 h和4 h后除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)基，冷PBS清洗3次，0.25%胰酶消化后離心，PBS清洗3次，流式細胞儀測定細胞熒光值。

1.2.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白和R8共修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)分布：HepG2肝癌細胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個／mL。取4只雄性裸鼠用0.4 g／kg水合氯醛麻醉，將準備好的HepG2肝癌細胞懸濁液皮下接種于裸鼠左右背部各一處，每個點接種0.1mL細胞懸濁液。接種后1～2周可見左右背部長出100～200 mm3腫瘤塊，證明接種成功。取5只接種成功后的裸鼠隨機分為5組，分別為生理鹽水組、LP組、TF-LP組、R8-LP組和TF／R8-LP組。

照“1.2.2”項下方法制備載近紅外熒光染料DIR的不同脂質(zhì)體，荷瘤裸鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體0.1mL，12 h后將小鼠用10%水合氯醛麻醉，于熒光活體成像系統(tǒng)下觀察并拍照（Ex＝630 nm，Em＝700 nm）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的表征 取制備得到的TF／R8-LP用馬爾文激光粒度儀測定粒度和zeta電位，平行測定3次。結(jié)果顯示TF／R8-LP的平均粒徑為（108.5±12.6）nm，多分散性系數(shù)為0.14，Zeta電位為（24.15±4.78）mV（見表1）。

表1 不同脂質(zhì)體的表征Tab.1 Characteristics of TF-LP，R8-LP and TF／R8-LP

2.2 脂質(zhì)體的血清穩(wěn)定性 血清穩(wěn)定性結(jié)果顯示：各組脂質(zhì)體在50%的血清中的透光率與其在FBS中的透光率的比值均大于90%，表明4種脂質(zhì)體24 h內(nèi)在血清中均具有較好的穩(wěn)定性（見圖1a）。各組脂質(zhì)體在50%血清中，粒徑保持穩(wěn)定（見圖1b）。

圖1 不同脂質(zhì)體在50%FBS中的透光率變化（a）和粒徑變化（b）Fig.1 Transmittance variation（a）and particle size（b）of different liposomes in 50%FBS

2.3 HepG2細胞對TF／R8-LP的攝取 細胞攝取實驗結(jié)果表明：腫瘤細胞對脂質(zhì)體的攝取隨著時間的延長而增加，TF／R8-LP在4 h攝取效率是2 h的1.85倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肝癌HepG2細胞在與脂質(zhì)體共同孵育4 h后對TF／R8-LP的攝取效率分別是R8-LP、TF-LP和LP的2.4倍、2.8倍和3.9倍，差異均有統(tǒng)計學意義（見圖2，P＜0.01）。

圖2 不同脂質(zhì)體與HepG2細胞共孵育2 h和4 h后的攝取效率**P＜0.01，與2 h相比；ΔΔP＜0.01，與 R8-LP和 TF-LP相比Fig.2 Efficiency of cellular uptake in vitro at2 h and 4 h incubation with different liposomes**P＜0.01，compared with 2h；ΔΔP＜0.01，compared with R8-LP and TF-LP

2.4 TF／R8-LP的體內(nèi)分布 荷瘤裸鼠活體成像實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)鐵蛋白和R8共修飾脂質(zhì)體組的荷瘤裸鼠腫瘤組織熒光最強，其次是轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)體和R8修飾脂質(zhì)體（見圖 3）。

圖3 載DIR的不同類型脂質(zhì)體在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布Fig.3 EX vivo images of given various DIR loaded liposomes

3 討論

理想的腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)不僅需要在全身給藥后將藥物濃集在腫瘤組織，而且還需要將藥物高效地傳遞到腫瘤細胞內(nèi)，從而將治療作用最大化并減少抗腫瘤藥物的不良反應。腫瘤組織內(nèi)部由于血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差、淋巴回流缺失，造成納米顆粒在此具有選擇性高通透性和滯留性，這種現(xiàn)象被稱作腫瘤組織的高通透性和滯留效應（Enhanced permeability and retention effect），簡稱 EPR效應［13-14］。研究已經(jīng)證實，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在多種腫瘤細胞表面都有大量的表達［15-16］，腫瘤細胞表面大量表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體成為了腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的重要靶點［17］。然而由于腫瘤細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有飽和效應，這也就限制了納米給藥系統(tǒng)進入腫瘤細胞的效率。本研究將轉(zhuǎn)鐵蛋白與細胞穿膜肽八聚精氨酸共同修飾到脂質(zhì)體表面，研究共修飾脂質(zhì)體的體外腫瘤細胞親和力和體內(nèi)靶向性。

研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)鐵蛋白與八聚精氨酸共修飾脂質(zhì)體的粒徑為110 nm左右。有研究顯示：納米載體的粒徑范圍在10～150 nm能夠有效避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，通過EPR效應到達腫瘤組織［18］。本實驗通過血清穩(wěn)定性模擬脂質(zhì)體在體內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示制備的脂質(zhì)體在50%血清中具有很好的穩(wěn)定性，因此可以推測共修飾脂質(zhì)體在體內(nèi)也會具有較好的穩(wěn)定性。細胞攝取實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過轉(zhuǎn)鐵蛋白和R8共修飾后，腫瘤細胞對脂質(zhì)體的攝取能力大大增強，顯著強于轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)體和R8修飾脂質(zhì)體（P＜0.05）。在體內(nèi)分布定性研究中，采用動物活體成像儀定性觀察動物體內(nèi)分布，是目前研究動物體內(nèi)分布較為快速，準確，直觀的新技術。近紅外染料穿透力強，干擾小，靈敏度高，常被用于進行小動物的活體成像研究［19］。本章選用近紅外染料DIR定性考察所構(gòu)建的脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)鐵蛋白和R8共修飾脂質(zhì)體在腫瘤組織熒光最強，明顯強于其他脂質(zhì)體。

綜上所述，本研究制備的轉(zhuǎn)鐵蛋白與R8共修飾脂質(zhì)體是一種潛在、高效的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。轉(zhuǎn)鐵蛋白和R8共修飾載脂質(zhì)體的腫瘤治療效果研究正在進行中。

［1］ Guo J，Gao X，Su L，et al.Aptamer-functionalized PE GPLGA nanoparticles for enhanced anti-glioma drug delivery［J］.Biomaterials，2011，32（31）：8010-8120.

［2］ Gao HL.A cascade targeting strategy for brain neuroglial cells employing nanoparticlesmodified with angiopep-2 peptide and EGFPEGF1 protein［J］.Biomaterials，2011，32（33）：8669-8675.

［3］ Qin Y.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for enhancing the brain delivery［J］.Int JPharm，2011，419（1-2）：85-95.

［4］ Kuai R.Targeted delivery of cargoes into a murine solid tumor by a cell-penetrating peptide and cleavable poly（ethylene glycol）comodified liposomal delivery system via systemic administration［J］.Mol.Pharmaceutics，2011，8（6），2151-2161.

［5］ Yao Q.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeuticefficacy on brain glioma in animals［J］.International Journal of Pharmaceutics，2011，420（2）：304-312.

［6］ Chee WG.Transferrin-conjugated nanoparticles of Poly（lactide）-D-a-Tocopheryl polyethylene glycol succinate diblock copolymer for targeted drug delivery across the blood brain barrier［J］.Biomaterials，2010，31（30）：7748-7757.

［7］ Ulbrich K，Hekmatara T，Herbert E，et al.Transferrin-and transferrin receptor-antibody-modified nanoparticles enable drug delivery across the blood-brain barrier（BBB）［J］.Eur JPharm Biopharm，2009，71（2）：251-256.

［8］ Alessia C，Isabella O，Silvia D.Transferrin receptor 2 is frequently expressed in human cancer cell lines［J］.Blood Cells，Molecules，and Diseases，2007，39（1）：82-91.

［9］ Shah N，Chaudhari K，Dantuluri P，et al.Paclitaxel-loaded PLGA nanparticles surfacemodified with transferrin and Pluronic P85，an in vitro cell line and in vivo biodistribution studies on rat model［J］.J Drug Target，2009，17（7）：533-542.

［10］ Chang J，Jallouli Y，Kroubi M，et al.Characterization of endocytosis of transferrin-coated PLGA nanoparticles by the blood-brain barrier［J］.Int JPharm 2009；379（2）：285-292.

［11］ Zhang QY.A pH-responsive a-helical cell penetrating peptidemediated liposomal delivery system［J］.Biomaterials，2013，34（32）：7980-7993.

［12］ Ying X.Dual-targeting daunorubicin liposomes improve the therapeutic efficacy of brain glioma in animals［J］.Journal of Controlled Release，2010，141（2）：183-192.

［13］ Raymond M.Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature［J］.Journal of liposome research，2002，12（8）：129-135.

［14］ Xiong XB.Enhanced Intracellular Uptake of Sterically Stabilized Liposomal Doxorubicin［J］.Pharmaceutical Research，2005，6（5）：933-939.

［15］ Li Z.Lipid-polymer hybrid nanoparticles：synthesis，characterization and applications［J］.Nano LIFE，2010，1（1）：163-173.

［16］ Jiang X.Solid tumor penetration by integrin-mediated pegylatedoly（trimethylene-carbonate）nanoparticles loaded with paclitaxel［J］.Biomaterials，2013，34（6）：1739-1746.

［17］ Ikramy A.Octaarginine-modified liposomes：Enhanced cellular uptake and controlled intracellular trafficking［J］.International Journal of Pharmaceutics，2008，354（1-2）：39-48.

［18］ Oba M.Cyclic RGD peptide-conjugated polyplex micelles as atargetable gene delivery system directed to cells possessingαvβ3 and αvβ5 integrins［J］.BioconjugChem，2007，18（5）：1415-1423.

［19］ Scott EN，Gescher AJ，Steward WP，et al.Development of dietary phytochemical chemopreventive agents：biomarkers and choice of dose for early clinical trials［J］.Cancer Prev Res（Phila Pa），2009，2（6）：525-530.

（編校：吳茜）

Preparation of transferrin and R8 co-modified liposome and study on its targeting to hepatoma

HAN Li-jie，LIUWeiΔ，DU Juan，WEIDong-dong

（Department of Radiotherapy，Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061001，China）

ObjectiveTo prepare transferring and R8 co-modified liposome（TF／R8-LP）for forhepatoma targeting.MethodsThe co-modified liposomewere prepared by film-ultrasonicmethod.The appearance，particle size，Zeta potentialwere evaluated.The cellular uptake by HepG2 cell in vitro was used to evaluate the targeting efficiency and in vivo imaging were used to evaluate the targeting efficiency.ResultsThe particle diameter of the co-modified liposome was（108.5±12.6）nm and the Zeta potentialwas（24.15±4.78）mV.The liposome kept stable in 50%FBS at 24 h.The result demonstrated that the co-modified liposome uptaken by HepG2 were 2.4，2.6 times higher than that of R8-LP and TF-LP，respectively（P＜0.05）.The evaluation of tumor spheroid penetration and in vivo imaging results showed the co-modified liposome had the strongest fluorescence intensity.ConclusionThe co-modified liposomemight serve as a promising hepatoma delivery system of antitumor drugs.

transferrin；R8；tumor targeting

R735.7

A

1005－1678（2014）04－0033－04

近年來，隨著現(xiàn)代生物研究的發(fā)展，腫瘤疾病的治療手段也日益豐富。其中腫瘤的靶向治療成為了腫瘤研究和治療的熱點［1-2］。八聚精氨酸（R8）是由8個精氨酸組成的直鏈肽，能夠穿過與之相接觸的任何細胞的細胞膜［3］，具有高效的穿膜作用，R8修飾的脂質(zhì)體已廣泛用于腫瘤靶向給藥研究，然而其缺乏選擇性限制了R8在全身系統(tǒng)給藥中的應用［4-5］。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是一種在正常細胞和腫瘤細胞表面都普遍存在的受體，但在腫瘤細胞的表面其表達量是正常細胞的4～5倍［6-8］。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種小分子糖蛋白，它可以與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合并在其介導下被細胞內(nèi)吞入細胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)鐵蛋白連接在載藥脂質(zhì)體上從而使后者具有一定的腫瘤靶向性。利用該方法來治療腫瘤疾病已經(jīng)被廣泛的研究并且取得了初步的成效，然而由于特異性受體的飽和效應，導致轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的納米給藥制劑的入胞能力受到一定的限制［9-10］。本研究旨在構(gòu)建轉(zhuǎn)鐵蛋白與R8共修飾的脂質(zhì)體，將轉(zhuǎn)鐵蛋白與腫瘤細胞的特異親和力和R8的高效穿膜肽作用結(jié)合，實現(xiàn)高效的腫瘤靶向給藥。

河北省衛(wèi)生廳2012醫(yī)學研究重點課題計劃（20120118）

韓立杰，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的放化療治療，E-mail：hanlijie52＠163.com；劉偉，通信作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤的放化療治療，E-mail：liuwei＠126.com。