金雀異黃素聯(lián)合阿霉素對卵巢癌A2780細(xì)胞增殖和荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響

唐琪，溫玉庫

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001）

金雀異黃素聯(lián)合阿霉素對卵巢癌A2780細(xì)胞增殖和荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響

唐琪，溫玉庫Δ

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001）

目的探討不同濃度的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素對卵巢癌A2780細(xì)胞增殖和荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響。方法將卵巢癌A2780細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后接種于裸鼠皮下，制備卵巢癌裸鼠模型。將40只造模成功的裸鼠隨機(jī)分為4組，即生理鹽水組、金雀異黃素聯(lián)合阿霉素低劑量組、中劑量組、高劑量組，腹腔注射給藥，每周1次。用藥4周后，處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，稱重，計(jì)算各組腫瘤抑制率。用免疫組化方法檢測各組腫瘤組織中c-myc的表達(dá)。分別采用低、中、高劑量金雀異黃素聯(lián)合阿霉素共同作用于卵巢癌A2780細(xì)胞，Western blot方法檢測各組細(xì)胞內(nèi)c-myc的表達(dá)，MTT檢測各組細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)與transwell法檢測各組細(xì)胞的侵襲能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期及凋亡率。結(jié)果與生理鹽水組相比，金雀異黃素聯(lián)合阿霉素中、高劑量組的抑瘤率分別為（40.26±4.25）%、（44.81±5.74）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，金雀異黃素聯(lián)合阿霉素中、高劑量組能明顯抑制c-myc的活化。金雀異黃素聯(lián)合阿霉素中、高劑量組能顯著降低卵巢癌A2780細(xì)胞中c-myc的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及降低侵襲能力，顯著升高G0／G1期細(xì)胞（P＜0.05），降低S期細(xì)胞（P＜0.05），且細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論一定劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素可在體內(nèi)抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的生長及體外抑制卵巢癌A2780細(xì)胞的增殖、降低侵襲能力及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過降低c-myc蛋白的表達(dá)，影響c-myc參與調(diào)控的癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程。

卵巢癌A2780；金雀異黃素；阿霉素；細(xì)胞增殖

卵巢癌起病隱匿，早期無明顯癥狀與體征，早期容易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移，其死亡率一直高居?jì)D科惡性腫瘤之首［1-2］。目前主要以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療等，但其五年生存率仍徘徊在30%左右［3-4］。目前，化療是治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌的主要手段，但化療藥物的細(xì)胞毒性大大降低了化療有效率。因此改變現(xiàn)有的治療方案以提高卵巢癌的存活率是當(dāng)前亟需解決的問題。近年來，隨著學(xué)者們對原癌基因的深入研究，及越來越多的原癌基因被發(fā)現(xiàn)，分子靶向治療已成為治療癌癥的重要手段。C-myc的過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，永生化、去分化和轉(zhuǎn)化等，在多種腫瘤形成過程中處于重要地位［5］。許多研究表明，c-myc在卵巢癌組織中高度表達(dá)，且與卵巢癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)［6-7］。金雀異黃素對多個(gè)腫瘤信號(hào)通路的靶點(diǎn)均具有調(diào)控作用［8-9］，通過對這些腫瘤靶點(diǎn)的調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。此外，金雀異黃素具有低毒性、低成本等優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為在人類主要的腫瘤防治中，是一種潛在的或者預(yù)防性質(zhì)的藥物。近年的研究［10］指出光敏素與金雀異黃素聯(lián)用可以在一定程度上誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，提示中藥在抗腫瘤治療中具有多靶點(diǎn)的特性，這在當(dāng)今腫瘤的靶向治療中具有一定優(yōu)勢。因此，本研究采用與化療藥物聯(lián)用效果較好的阿霉素與金雀異黃素聯(lián)用，以探討其對卵巢瘤的靶向作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB／e2nu／nu品系的裸鼠40只，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002，雌雄各半，4～5周齡，體質(zhì)量（18.0±1.5）g。SP免疫組化試劑盒購自Maxim Biotech公司。Elite Esp型流式細(xì)胞儀為美國Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌裸鼠模型的建立：選取處于對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞A2780，用含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周傳代2次。用0.25%胰酶消化后，將數(shù)量為2×107的細(xì)胞懸液注入裸鼠右后肢根部皮下，0.2mL／只。腫瘤生長10 d后，觀察瘤塊生長情況。

1.2.2 分組給藥：將成瘤裸鼠分為生理鹽水組、金雀異黃素聯(lián)合阿霉素低劑量治療組、中劑量治療組和高劑量治療組共4組。每組10只，雌雄各半，分別腹腔注射0.2 mL生理鹽水、10mg／kg、20 mg／kg、30 mg／kg c-myc金雀異黃素聯(lián)合阿霉素20mg／m2，每周1次。給藥4次后于第28天處死裸鼠，從右后肢根部皮下完整剝?nèi)∧[瘤組織稱重。計(jì)算抑瘤率：（對照組瘤平均質(zhì)量—給藥組瘤平均質(zhì)量）／對照組瘤平均質(zhì)量×100%。

1.2.3 免疫組化檢測：用福爾馬林固定腫瘤組織，石蠟包埋，常規(guī)切片，片厚4μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O237℃孵育10min。PBS沖洗，醫(yī)學(xué)微波進(jìn)行抗原修復(fù)。正常羊血清工作液37℃封閉10 min，吸走工作液，滴加1∶100稀釋的c-myc單克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）。滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，光鏡分析。

1.2.4 Western blot檢測：體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞A2780，分別加入金雀異黃素聯(lián)合阿霉素1、2、4μg／mL，并以卵巢正常細(xì)胞LEC1作為空白對照。作用24、48、72 h后收集細(xì)胞，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液RIPA，放置冰上裂解30min，每10min蝸旋器上蝸旋1min。13 000 r／min，48℃離心10min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將細(xì)胞裂解液，經(jīng)蛋白定量后，取10 ug蛋白裂解液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠，利用電轉(zhuǎn)法將凝膠上的目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。c-myc單克隆抗體孵育過夜，洗滌后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育，化學(xué)發(fā)光法顯影拍照。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測：胰酶消化A2780及LEC1細(xì)胞，分別將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，1×104個(gè)／孔，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。分別加入金雀異黃素聯(lián)合阿霉素1、2μg／mL、4μg／mL，分別培養(yǎng) 1、2、3、4、5 d。于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入5mg／mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清液，加入DMSO 150μL，搖床振蕩10min，570 nm波長測吸光度值，以A570值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：分別將A2780及LEC1細(xì)胞胰酶消化，制備單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，分別加入1、2、4μg／mL金雀異黃素聯(lián)合阿霉素藥物，作用4 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，胰酶消化后顯微鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞黏附率：黏附細(xì)胞總數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：于transwell板上室加入Matrigel膠（Becton Dickinson Company）與無血清培養(yǎng)基混合液，37℃，30min，使Matrigel聚合成膠。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)A2780及LEC1細(xì)胞過夜，次日消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。每個(gè)transwell板上室加入100μL細(xì)胞懸液（5×105個(gè)細(xì)胞），分別加入金雀異黃素聯(lián)合阿霉素藥物，給藥濃度為1、2、4μg／mL，下室加入500μL NIH3T3細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清。培養(yǎng)72 h后，濕棉簽輕輕拭去聚碳酯膜和Matrigel凝膠表面的細(xì)胞。小心取出上室，甲醇固定30min。蘇木素染色，脫水，切取碳酯膜于載玻片上中性樹脂封片，400倍高倍鏡下計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測：A2780及LEC1細(xì)胞分別接種5×106個(gè)于6孔板，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜。第二天，吸棄培養(yǎng)基上清，分別加入1、2、4μg／mL金雀異黃素聯(lián)合阿霉素藥物，培養(yǎng)72 h。胰酶消化，1 000r／min離心，棄上清。PBS洗滌3次后，預(yù)冷的75%乙醇固定，碘化丙啶（PI）室溫避光孵育15min。采用Elite Esp型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 各組抑瘤率結(jié)果比較 金雀異黃素聯(lián)合阿霉素可明顯抑制裸鼠模型實(shí)體瘤的生長，且呈劑量依賴性（見表1）。其中，中劑量與高劑量組的抑瘤率明顯高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 金雀異黃素聯(lián)合阿霉素對裸鼠模型的抑瘤作用

2.2 裸鼠卵巢癌實(shí)體瘤組織c-cmy表達(dá)檢測 裸鼠模型的卵巢癌實(shí)體瘤稱完重量后，利用c-myc單克隆抗體將組織進(jìn)行免疫組化檢測。結(jié)果顯示，c-myc的陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕褐色。中、高劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素治療后，卵巢癌組織的陽性信號(hào)明顯減少（見圖1），表明一定濃度的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素可抑制卵巢癌組織c-myc的表達(dá)。

圖1 卵巢癌組織的c-myc表達(dá)檢測（×400）Fig.1 C-myc expression level in ovarian tissue（×400）

2.3 卵巢癌細(xì)胞A2780的c-cmy表達(dá)檢測 采用不同濃度的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素處理卵巢癌細(xì)胞A2780，分別于處理后24、48、72 h收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)的c-myc蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用A2780細(xì)胞后，c-myc蛋白表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性，但不呈時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系（見圖2）。

圖2 卵巢癌細(xì)胞的c-myc表達(dá)水平檢測*P＜0.05，與A2780細(xì)胞對照組比較，compared with A2780 cell control groupFig.2 C-myc expression level in ovarian cell

2.4 細(xì)胞增殖力檢測 采用不同濃度的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素分別作用于卵巢癌細(xì)胞A2780及卵巢正常細(xì)胞LEC1，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，并繪制細(xì)胞的生長曲線。2μg／mL、4μg／mL的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞A2780的生長（見圖3），但對正常卵巢細(xì)胞LEC1的生長無影響（見圖4）。

圖3 A2780細(xì)胞生長曲線Fig.3 A2780 cell growth curve line

圖4 LEC1細(xì)胞生長曲線Fig.4 LEC1 cell growth curve line

2.5 細(xì)胞黏附力檢測 采用不同濃度金雀異黃素聯(lián)合阿霉素分別作用于卵巢癌細(xì)胞A2780和卵巢正常細(xì)胞LEC1，4 h后計(jì)算各組的細(xì)胞黏附率。結(jié)果顯示：2μg／mL和4μg／mL的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素可明顯降低A2780細(xì)胞的粘附力（P＜0.05），而對LEC1細(xì)胞無影響（見表2）。

表2 藥物處理后2種細(xì)胞粘附率比較（%）Tab.2 Cell adherence rate of two cell lines after treated with drugs（%）

2.6 細(xì)胞遷移力檢測 2μg／mL、4μg／mL c-myc金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用A2780細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞遷移率明顯低于空白對照組（P＜0.05），說明一定劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素可降低A2780細(xì)胞的遷移力（見表3）。

表3 細(xì)胞的遷移率（%）Tab.3 Cellmigration rate（%）

2.7 細(xì)胞周期檢測 與對照組相比，2μg／mL、4μg／mL c-myc金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用A2780后，G0／G1期細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05），S期細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05），說明一定劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用可使A2780細(xì)胞停滯于G0／G1期，抑制細(xì)胞的增殖。而金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用LEC1后，各組細(xì)胞的周期分布情況無明顯差異，說明金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用不影響LEC1細(xì)胞的增殖（見表4）。

表4 細(xì)胞周期的分布（%）Tab.4 Cell cycle distribution（%）

2.8 細(xì)胞凋亡率檢測 2μg／mL、4μg／mL金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組（P＜0.05），且金雀異黃素聯(lián)合阿霉素對LEC1細(xì)胞無促凋亡作用。說明一定劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡（見圖5、表5）。

圖5 2種細(xì)胞DNA含量直方圖M1橫線下面為凋亡細(xì)胞的DNA含量Fig.5 Histograms of cellular DNA contents in two kinds of cells Under the horizontal line are DNA contents in apoptosis cells

表5 細(xì)胞的凋亡率（%）Tab.5 Cell apoptosis rate（%）

3 討論

目前，雖然卵巢癌靶向治療相對滯后，但也取得了不少進(jìn)展，目前已采用的靶向治療策略包括表皮生長因子受體（EGFR）靶向治療，血管生成抑制劑，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，多靶點(diǎn)抑制劑，mTOR抑制劑、c-Met抑制劑，IGF-1R抑制劑，HSP90抑制劑等。然而，除EGFR靶向治療藥物曲妥珠單抗外，卵巢癌靶向治療目前尚無其他大規(guī)模循證醫(yī)學(xué)證據(jù)得出最終Ⅲ期研究結(jié)論。例如，EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼已被批準(zhǔn)用于治療非小細(xì)胞肺癌，但在卵巢癌的治療使用方面目前尚處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的抗體VEGF貝伐珠單抗，用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的一線治療，以及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一、二線治療，但在卵巢癌方面的研究尚處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。CMet抑制劑Foretinib用于低分化進(jìn)展期卵巢癌多中心Ⅱ期臨床研究的中期結(jié)果顯示卵巢癌中C-Met基因擴(kuò)增率與Foretinib療效無關(guān)，F(xiàn)oretinib的療效預(yù)測指標(biāo)尚不明確［9-10］?？笽GF-1R抗體Figitumumab（CP-751871）在卵巢癌治療中處于Ⅰ期臨床研究階段［11-12］，且常見不良反應(yīng)為高血糖及脫水，其藥物有效性及安全性尚需進(jìn)一步試驗(yàn)數(shù)據(jù)以證實(shí)。CDKs抑制劑favopiridol的Ⅱ期臨床研究中發(fā)現(xiàn)治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌患者的有效率低，不良反應(yīng)發(fā)生率高［13-15］。卵巢癌的靶向治療相對滯后可能和卵巢癌發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性或者西方國家卵巢癌發(fā)病率相對低、病例數(shù)較少有關(guān)。但是，卵巢癌的靶向藥物臨床試驗(yàn)，及新的靶向藥物的開發(fā)是治療卵巢癌的需求，也是目前的研究熱點(diǎn)。

到目前為止，尚未出現(xiàn)有關(guān)金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用治療卵巢癌的研究報(bào)道。而本研究就以金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用為研究對象，從體內(nèi)及體外探討其對卵巢癌的增殖，侵襲及凋亡的影響。結(jié)果顯示，在體內(nèi)，一定劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用可抑制卵巢癌實(shí)體瘤的生長，并阻斷c-myc基因的激活。在體外，一定劑量的金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，降低其侵襲能力，促細(xì)胞的凋亡，并降低細(xì)胞內(nèi)的c-myc蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明，金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用可阻斷c-myc蛋白的激活，降低卵巢癌細(xì)胞的c-myc蛋白表達(dá)，從而影響c-myc蛋白參與的細(xì)胞生長分化、凋亡和細(xì)胞周期的進(jìn)程。然而，本文僅僅是從細(xì)胞水平及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來研究金雀異黃素聯(lián)合阿霉素對卵巢癌的作用，其距離臨床治療還有很遠(yuǎn)的研究道路。因?yàn)?，每個(gè)癌癥靶向藥物上市前，都必須經(jīng)歷過大量的臨床試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證其安全性及有效性，這正是卵巢癌靶向藥物研究相對滯后的主要原因。但在卵巢癌發(fā)生率居于惡性腫瘤首位的中國，其靶向藥物的臨床試驗(yàn)研究或許會(huì)比西方國家更易進(jìn)行。本文為金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用治療卵巢癌的進(jìn)一步臨床試驗(yàn)研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，希望能與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究，并逐步進(jìn)行金雀異黃素聯(lián)合阿霉素作用治療卵巢癌的臨床試驗(yàn)研究，期望能取得較好的治療效果。

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（編校：吳茜）

Study on the effect of genistein and adriamycin on the proliferation of human ovarian cell A2780 and grow th of tumor bearing nudem ice

TANG Qi，WEN Yu-kuΔ

（Department of Obstetrics and Gynecology，The Third Hospital Affiliated to Liaoning Medical University，Jingzhou 121001，China）

ObjectiveTo study the effects of genistein and adriamycin on the proliferation of human ovarian cell A2780 and growth of tumor bearing nudemice.MethodsThe ovarian cancer cell A2780 suspension were inoculated into nude mice（n＝40）to establish the animalmodels with ovarian tumor.Thesemodel ratswere randomly divided into four groups，saline group and different genistein concentrations combined with adriamycin treatment group（high-dose，middle-dose and low-dose group）by intraperitoneal injection once aweek.After treatment for fourweeks，the ovarian tumors in all rats were peeled off and weighted for the measurement of tumor inhibition rate.The expression of c-myc in ovarian tumors were detected by immunohistochemistry.In vitro，after affected by different genistein concentrations combined with adriamycin，the expression of c-myc in A2780 cell of each group were detected by western blot.The proliferation of A2780 cellwere determined by MTTmethod，and the invasiveness of cell by cell adhesion and transwell assay，the apoptosis rate and cell cycle were measured by flow cytometry.ResultsThe tumor inhibition rates in middle-dose（40.26±4.25）%and high-dose groups［，（44.81±5.74）%］）were significantly lower than saline group（P＜0.05）.Immunohistochemistry results showed that c-myc monoclonal antibody in middle-dose and high-dose groups can significantly inhibit the activation of c-myc in ovarian carcinoma tissue.Compared with control group，the expression of c-myc in A2780 cellwere significantly decreased，the proliferation and invasiveness of cellwere inhibited，cells in G0／G1 phase were significantly increased（P＜0.05）and in S phase were（P＜0.05）decreased，and the apoptosiswere induced by genistein combined with adriamycin in middle-dose and high-dose（P＜0.05）.ConclusionGenistein combined with adriamycin in certain doses could inhibit the proliferation and invasiveness of ovarian carcinoma，and induce its apoptosis.Themechanism may be related to the decreased expression of c-myc.

ovarian carcinoma；genistein；adriamycin；cell proliferation

R73－37

A

1005－1678（2014）04－0028－05

遼寧省自然科學(xué)基金（201202265）

唐琪，女，碩士，研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)，E-mail：49095530＠qq.com；溫玉庫，通信作者，男，碩士，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：lyfssy＠126.com。