蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注心肌組織iNOS和eNOS mRNA表達(dá)的影響*

錢國(guó)強(qiáng) 丁晶晶 尹曉峰 李 茹 趙國(guó)平

1黃淮學(xué)院護(hù)理學(xué)系，河南駐馬店 463000 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510632

研究[1]表明，多酚類化合物，包括黃酮類和酚酸具有抗氧化、降糖和抗高血壓等多種功能。自從類黃酮被證明能降低慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)后，近期研究便集中在其對(duì)心血管疾病相關(guān)炎癥的預(yù)防上[2]。蘆丁(RT)是主要的黃酮類化合物之一，也被稱為維生素P，具有抗血小板、抗病毒、抗高血壓、自由基清除活性和抗氧化能力[3]。最新研究[4]發(fā)現(xiàn)，蘆丁對(duì)缺血再灌注損傷有干預(yù)作用。由于缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IP)可明顯減輕隨后的缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)誘導(dǎo)的一氧化氮(NO)合成有關(guān)。因此，本文建立SD大鼠心肌缺血再灌注模型，探討蘆丁缺血預(yù)處理對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

1.2 試劑及器材

蘆丁注射液和L-NAME(Sigma公司)，NO檢測(cè)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，CK-MB測(cè)定試劑盒(北京華宇億康生物工程技術(shù)有限公司)。全自動(dòng)生化分析儀(7020，日立)，動(dòng)物呼吸機(jī)(ALC-V，上海奧爾科特生物科技有限公司)，全波長(zhǎng)熒光掃描酶標(biāo)儀(Safire 2，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，心電圖機(jī)(ASB240V，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都遨生電子有限公司)，PCR儀(CFD-3120，Bio-Rad)。

1.3 心肌缺血再灌注動(dòng)物模型建立

SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg體質(zhì)量)，固定后行氣管切開(kāi)，氣管插管，連接呼吸機(jī)并給予機(jī)械通氣，通氣量為5 ml/100 g體質(zhì)量；呼吸頻率為60～80次/min，呼吸比為2：1，予呼氣末持續(xù)正壓呼吸，于胸骨左緣2～4肋間打開(kāi)胸腔及心包膜，暴露心臟；在肺動(dòng)脈圓錐右緣、平左心耳下緣1～2 mm處，經(jīng)左冠狀動(dòng)脈下淺層心肌穿5/0號(hào)絲線，結(jié)扎，模型復(fù)制的可靠性用連續(xù)監(jiān)視ECGⅡ?qū)?lián)的變化來(lái)判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

32只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、蘆丁組和L-NAME組，每組8只。對(duì)照組未經(jīng)缺血再灌注處理；模型組SD大鼠心肌缺血30 min再灌注120 min后取材；蘆丁組于實(shí)驗(yàn)前30 min按50 mg/kg股靜脈注射蘆丁注射液，再灌注120 min后取材；L-NAME組于實(shí)驗(yàn)前30 min按50 mg/kg股靜脈注射蘆丁注射液，并于再灌注前15 min按30 mg/kg股靜脈給予L-NAME，再灌注120 min后取材。

1.5 血清NO水平和CK-MB濃度檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血后靜置30 min，4 ℃離心15 min，取血清均按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。

1.6 eNOS和iNOS mRNA表達(dá)的測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定eNOS和iNOS mRNA的含量，以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH引物為：上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′和下游5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′；eNOS引物為：上游5′-CGA GAT ATC TTC AGT CCC AAG C-3′和下游5′-GTG GAT TTG CTG CTC TCT AGG-3′；iNOS引物設(shè)計(jì)為：上游5′-TCT GTG CCT TTG CTG ATG AC-3′和下游5′-CAT GGT GAA CAC GTT CTT GG-3′。RNA抽提按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，測(cè)純度OD260 /290在1.9～2.1之間良好，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將反應(yīng)設(shè)為50 μl體系，95 ℃變性2 min，40循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s)，完成實(shí)驗(yàn)后數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清NO、CK-MB水平

與對(duì)照組比較，模型組血清NO水平明顯降低，CK-MB水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆丁組血清NO水平明顯升高，CK-MB水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清NO、CK-MB水平的比較(n=8，±s)

與對(duì)照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01

2.2 各組大鼠心肌組織eNOS和iNOS mRNA的表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組心肌組織eNOS mRNA表達(dá)明顯降低，iNOS mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆丁組心肌組織eNOS mRNA表達(dá)明顯升高，iNOS mRNA表達(dá)明顯明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織eNOS和iNOS mRNA的比較(n=8，2-ΔΔct，±s)

與對(duì)照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01

3 討論

1987年P(guān)almer等[5]發(fā)現(xiàn)NO就是內(nèi)皮源性舒張因子(endothelium-derived relaxing factor，EDRF)，目前研究認(rèn)為在基礎(chǔ)狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO釋放對(duì)維持心血管系統(tǒng)處于恒定的舒張活性狀態(tài)，調(diào)節(jié)血壓，調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈基礎(chǔ)張力和心肌血流灌注有重要作用。NO使血小板中cGMP水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)游離鈣進(jìn)入亞細(xì)胞器而使其濃度降低，從而抑制其聚集黏附[6]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及粒細(xì)胞中均有NO存在，在炎癥時(shí)NO過(guò)量產(chǎn)生可以使血管通透性增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白滲出加劇。有研究[5]提示心肌缺血再灌注后NO生成受損，應(yīng)用NO前體L-精氨酸可增加NO產(chǎn)生，具有保護(hù)作用。此外，證實(shí)NO對(duì)缺血再灌注有保護(hù)作用[7]，但是，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L-NAME減少了NO的生成，并未加重?fù)p傷[8]；也有部分研究[9]表明減少NO生成，損傷明顯加重。在缺血-再灌注心肌，NO產(chǎn)生大量增加，應(yīng)用NOS抑制劑L-單甲基精氨酸(L-NMMA)和L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制NO的產(chǎn)生，能夠減低心肌損傷[10]；也有研究[11]發(fā)現(xiàn)這些過(guò)量NO的產(chǎn)生系心肌iNOS活性升高所致，過(guò)量NO參與心肌脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷心肌。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，缺血再灌注的心肌iNOS mRNA表達(dá)升高，eNOS mRNA表達(dá)降低，再灌注期間NO生成減少，CK-MB生成增加。而蘆丁對(duì)缺血再灌注心肌有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)iNOS和eNOS mRNA表達(dá)，調(diào)節(jié)NO生成有關(guān)。

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