非小細胞肺癌患者腫瘤和癌旁組織p14ARF的甲基化狀態(tài)檢測及臨床意義

胡志亮 沈 毅 田凱華△ 李 論 李 瑋

(1青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003；2濟寧市第二人民醫(yī)院,山東 濟寧 272049)

肺癌是人類最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率日益提高， 80%左右的肺癌患者不能得到早期診斷而失去手術治療的時機[1]。因此，肺癌的早期診斷和治療是困擾醫(yī)療人員的主要問題。肺癌的產(chǎn)生涉及多種因素[2]。肺癌抑癌基因甲基化的異常升高在肺癌的發(fā)病過程中起了重要作用，啟動子區(qū)異常甲基化作為p14ARF基因失活的重要形式可能參與了肺癌的發(fā)生[3]。我們檢測了非小細胞肺癌癌患者腫瘤和癌旁組織中p14ARF啟動子區(qū)甲基化情況，并對它們的臨床病理意義進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

107例肺癌組織及相應癌旁正常組織取自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科新鮮手術標本，均經(jīng)術后病理學確診。男性81例，女性26例；年齡35～77歲，中位年齡為58.2歲。其中鱗癌43例，腺癌56例，其他8例；根據(jù)1997年UICC修訂的肺癌分期標準：Ⅰ期37例，Ⅱ期31例，Ⅲ期29例；余參見表1。取其癌旁(距腫瘤邊緣>10cm)正常組織107例。所有標本均無壞死組織，術前未進行化療、放療。

表1 107例非小細胞肺癌患者p14ARF啟動子的甲基化狀態(tài)分布(n，%)

1.2 方法

1.2.1DNA抽提 DNA抽提按照《分子克隆》常規(guī)進行。

1.2.2p14ARF甲基化檢測 巢氏甲基化特異性PCR(NMSP)：1)基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾：目的使未甲基化的胞嘧啶經(jīng)脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぁ?) PCR為基礎的甲基化分析：分別設計針對啟動子區(qū)甲基化和非甲基化DNA的引物。

1.3 結果判定

檢測甲基化特異性引物擴增產(chǎn)物存在為甲基化陽性；反之，不存在即為甲基化陰性，而且需非甲基化特異性引物擴增產(chǎn)物同時存在才可判定甲基化陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進Pearson χ2檢驗和Spearman相關分析。

2 結 果

2.1 p14ARF啟動子通過巢氏甲基化技術的表達結果

p14ARF基因啟動子的甲基化在原發(fā)性肺癌腫檢測瘤組織和癌旁組織分別是33.6%，12.1%。在腫瘤組織和癌旁組織中的p14ARF啟動子的甲基化有顯著的差異(χ2= 12.811 ，P<0.001)。我們證明它們的Pearson相關性分析呈負相關， 見表2。

表2 兩組間甲基化分布及相關性比較(n，%)

2.2 臨床特征和p14ARF啟動子甲基化之間的關系

p14ARF啟動子甲基化陽性、陰性在性別、年齡、TNM分期和腫瘤大小方面無明顯差異。而在吸煙和不吸煙之間有顯著性差異。吸煙的明顯高于不吸煙的(χ2=4.378，P=0.023)。如表1。

54例腺癌中25例p14ARF啟動子發(fā)生甲基化，43例鱗癌中甲基化有9例，腺癌的p14ARF啟動子甲基化明顯高于鱗癌的(t=5.059，P=0.019)，如表3所示。

表3 不同組織類型組間p14ARF啟動子發(fā)生甲基化的比較(n)

2.3 p14ARF啟動子甲基化電泳結果

107例患者中，腫瘤組織發(fā)現(xiàn)36條甲基化帶，而在癌旁組織中只有13條甲基化帶，顯示p14ARF啟動子甲基化在腫瘤組織中的甲基化頻率顯著高于相應癌旁組織。在所有分組中，第13例患者最具有代表性，如圖1。

MA：DNA分子量標記物 M:啟動子p14ARF的甲基化 U：啟動子p14ARF的非甲基化 TT：腫瘤組織；DC:癌旁組織

圖1 第13例患者p14ARF啟動子甲基化特異性PCR電泳結果

該例肺癌病人中癌組織中存在明顯甲基化擴增條帶(132bp)，而在癌旁組織中沒有甲基化條帶出現(xiàn)。

3 討論

隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)基因突變并非腫瘤發(fā)生的唯一原因。甲基和一些核苷酸序列或組蛋白結合會改變“核酸-蛋白復合物”的形態(tài)，一些基因的表達發(fā)生改變。因此在未改變DNA的序列的情況下，這些變化仍然能夠影響細胞的功能，被稱為“表觀遺傳學”。表觀遺傳學在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色，由此可以解釋當人體遇到外界條件變化，諸如致癌物質、環(huán)境變化、精神打擊等情況時，機體DNA序列并未發(fā)生實質的改變，但表觀遺傳卻會發(fā)生了變化，導致細胞癌變。DNA甲基化被認為是表觀遺傳學的主要機制之一，對其研究最早也最為清晰的表觀遺傳修飾方式[4]。抑癌基因以及相關基因啟動子區(qū)的甲基化會導致基因的失活，從而引發(fā)組織癌變和促進腫瘤形成[5]。p14ARF啟動子區(qū)的異常甲基化同樣被認為在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮了重要作用。

基因的突變、純合型缺失、雜合型缺失和啟動子區(qū)異常甲基化等是p14ARF基因的主要失活機制。p14ARF啟動子區(qū)甲基化在多種人類腫瘤中均有報道。Esteller等在一組結直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)p14ARF啟動子區(qū)甲基化陽性率為31%[6]。Weihnauch等檢測了19例原發(fā)性肝血管肉瘤中啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，報告甲基化陽性率是26%，曾經(jīng)指出CpG啟動子區(qū)發(fā)生甲基化是p14ARF基因失活的重要方式[7]。近來，Kim等針對p14ARF啟動子區(qū)甲基化情況是否吸煙的因素有關系做了檢測，其結果甲基化陽性率為9%[8]。

資料顯示I期肺癌患者的5年生存率約為60%，Ⅱ-Ⅳ期臨床肺癌的5年生存率從40%到5%之間[9]。這主要歸咎于缺乏可靠有效的早期發(fā)現(xiàn)和診斷的手段。p14ARF基因啟動子區(qū)的異常甲基化在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，是一個早期事件，同時被認為是可以用MSP技術檢測到的潛在的早期診斷標志物[10]，可以作為癌癥早期診斷的一種輔助方法，并對其預后具有一定預測價值[11]。通過Spearman相關分析，p14ARF啟動子的甲基化情況在腫瘤組織中和相應癌旁組織中相關性極差。如果我們還可以進一步檢測在血液中p14ARF啟動子的甲基化狀況與腫瘤的關系，這將對我們早期診斷肺癌提供一個血液學標準。

由于在標本中DNA比較稀少，我們進行了更敏感的改良巢甲基化特異性RCR檢測方法，為肺癌的早期診斷提供依據(jù)。我們的研究與以往報告的結果幾乎一致。我們發(fā)現(xiàn)p14ARF啟動子的甲基化在吸煙和不吸煙患者之間有顯著差異(χ2=4.378，P=0.023)。目前的研究結果已經(jīng)證明，吸煙是肺癌的主要促發(fā)因素，如表1所示，在單因素分析中，我們也證明吸煙是一個重要的危險因素。

我們的研究同樣顯示腺癌中的p14ARF啟動子甲基化明顯高于鱗癌。腺癌比鱗癌在應用靶向藥物治療方面更有價值、更加敏感及突出優(yōu)勢，臨床研究也顯示化療的敏感性鱗癌明顯優(yōu)于腺癌。表觀遺傳學改變可以干擾化療敏感性，p14ARF啟動子的甲基化可能使肺癌腺癌的化療的敏感性下調(diào)。這提示改變p14ARF啟動子甲基化狀態(tài)可以提高化療的敏感性。

在本文中，TNM分期是最危險的因素，p14ARF啟動子甲基化危險性排名僅次于吸煙，位于第三。在先前的研究中，還沒有直接的證據(jù)可以證明p14ARF啟動子甲基化作為診斷依據(jù)，但目前的研究結果為今后的臨床和基礎研究提供了一種特殊的方法。并且我們今后的研究中正在考慮通過p14ARF啟動子去甲基化來提高化療及放療的敏感性，去治療非小細胞肺癌病人。

在本文中存在以下幾個限制：首先，p14ARF啟動子甲基化需要獲得組織標本，然而對早期患者則非常困難；其次，作為前瞻性研究，對臨床特征評價不夠精確地；再次，收集的病例數(shù)偏少，分離組織中的DNA也是不完美，特別是存放已久的組織標本。因此，我們的數(shù)據(jù)的確認需要進一步驗證，通過的多中心、大樣本的測試方法。

通過檢測p14ARF基因啟動子甲基化在非小細胞肺癌腫瘤及癌旁組織中的表達情況，研究p14ARF啟動子區(qū)甲基化在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機制，我們認為檢測p14ARF基因甲基化狀態(tài)可作為肺癌早期診斷或判斷預后的一個有價值的生物學標志。在將來的研究中，我們有可能尋找合適的去甲基化試劑，恢復抑癌基因的活性，為抗腫瘤治療及基因干擾治療提供一種思路和理論基礎。

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