脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料制備及生物相容性實(shí)驗(yàn)研究*

甄恩明 姜?jiǎng)傆?劉洪偉 楊兆安 馬建軍

(1 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272011； 2 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

目前，利用組織工程原理構(gòu)建人工涎腺組織為涎腺組織再生提供新的思路。生物材料的制備是組織工程一個(gè)重要組成部分，要求種子細(xì)胞能與制備的支架材料形成三維空間復(fù)合體，并且在該復(fù)合體中支架材料具有引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要作用。目前還未找到一種理想的生物支架材料用于涎腺組織工程的研究。我們已對(duì)采取凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)進(jìn)行組織學(xué)特征的觀察[1]。本文通過體外毒性試驗(yàn)、全身急性毒性及亞毒性試驗(yàn)、細(xì)胞相容性等評(píng)價(jià)脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)的生物相容性，證明采取凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)是良好的涎腺組織工程支架材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年新西蘭大白兔，雄性，體重2～3kg，提供單位(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院龍灣實(shí)驗(yàn)室)，將動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物房，室溫(23±1)℃，濕度(50±10)%，噪音60Db,正常進(jìn)飲食。

1.1.2主要試劑和儀器 磷酸鹽緩沖液(Gbico,美國)；脫氧膽酸鈉鹽(奧博星，中國)；DNaseⅠ(MBI，立陶宛)；RNaseA(MBI，立陶宛)；DMEM/F12(1∶1)(Gbico,美國)。722型分光光度計(jì)(天翔，中國)；掃描電鏡(HITACHI S-3000N，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料制備 通過凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)[1]：無菌條件下，取兔的新鮮腮腺，磷酸鹽緩沖液充分沖洗，三蒸水充分漂洗，放置于-80℃深低溫冰箱中冷凍1h，在室溫下解凍；將解凍的腮腺組織放置于蒸餾水內(nèi),在室溫下浸泡6h，2h換液1次；將組織置于3%的脫氧膽酸鈉鹽蒸餾水溶液中(加適量1mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8～9)震蕩4h(恒溫回旋振蕩器內(nèi)持續(xù)振蕩，25℃100r/min)；繼續(xù)蒸餾水中振蕩3h，每小時(shí)更換液體1次；放置于1ku/ml DNaseⅠ及RNaseA混合液中振蕩30min；然后放置于蒸餾水中浸泡3h，每小時(shí)換液1次；最后將處理后的腮腺組織放置在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，60Co照射消毒，照射劑量215 Gy，消毒后放在-80℃冰箱保存。

1.2.2腮腺腺細(xì)胞分離和培養(yǎng) 腮腺細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特征鑒定參見Fujita-Yoshigaki J 的文章[2]具體操作如下：無菌條件下取健康的新西蘭大白兔(體重2～3kg)腮腺組織。Hank's液清洗數(shù)次,去除包膜、脂肪、血管及結(jié)締組織。剪碎，膠原酶消化，過濾，離心，細(xì)胞懸浮于2ml完全培養(yǎng)液：DMEM/F12(1∶1)，含10%FBS，5g/ml胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，100ng/ml氫化可的松，1%抗生素，細(xì)胞懸液緩慢移至另一裝有10ml完全培養(yǎng)液的15ml離心管中液面上層。37℃放置10min，收集下層2ml細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以2×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于5%CO2、37℃，培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)3d后進(jìn)行第1次換液，原代細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至6d后見細(xì)胞大量生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)瓶底壁，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。

1.2.3材料浸提液的制備 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：ISO10993：12(GB/T16886.12)，將脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料與DMEM/F12培養(yǎng)液按照0.2g/ml比例將材料放入DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%FBS)中，37℃下放置72h來制備浸提液用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)；按0.2g∶1ml的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料與生理鹽水的比例進(jìn)行萃取，條件為37℃，時(shí)間為72h用于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)。萃取液應(yīng)在2h內(nèi)使用完畢。

1.2.4體外細(xì)胞毒性試驗(yàn) 取同體積的浸提液與DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%FBS)混合稀釋成濃度50%的浸提液。取第3代生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài)良好的腮腺細(xì)胞，以1×107/L密度接種于3塊96孔板上，5孔/組，100μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸出原培養(yǎng)液。對(duì)照組(A組)加入新配制的DMEM/F12(10% FBS)100μl，實(shí)驗(yàn)組分別在96孔板中加入濃度為50%(B組)和100%(C組)浸提液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在第3天、第5天、第7天取出96孔培養(yǎng)板，將5g/L的MTT 20μl/孔加到每個(gè)孔中繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后倒出培養(yǎng)液，將DMSO100μl/孔加到每個(gè)孔中震蕩10min，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以490nm波長(zhǎng)測(cè)A值。評(píng)估脫細(xì)胞基質(zhì)材料的毒性通過計(jì)算相對(duì)增值率(relative growth rate，RGR)來評(píng)估：RGR=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.5急性毒性試驗(yàn) 隨機(jī)選取健康的新西蘭大白兔10只，體重2～3kg，隨機(jī)分成2組，5只每組，飼養(yǎng)在相同環(huán)境和條件下。實(shí)驗(yàn)組按照15ml/kg將脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進(jìn)行萃取，37℃ 72h制備浸提液)注入兔的腹腔，將等量生理鹽水注入對(duì)照組兔的腹腔，注射后24、48、72h分別觀察兔的神志、精神、呼吸等一般狀況及可能發(fā)生的不良反應(yīng)。

1.2.6亞急性毒性試驗(yàn) 隨機(jī)選取新西蘭大白兔10只，體重2～3kg，稱重，在相同環(huán)境和條件下飼養(yǎng)，并隨機(jī)分成2組，5只/組。實(shí)驗(yàn)組將脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進(jìn)行萃取，37℃ 72h制備浸提液)注入兔的腹腔，每周5次，對(duì)照組將等量生理鹽水注入兔的腹腔，1個(gè)月后稱重后取心、肝、肺、腎組織做病理學(xué)檢查。

1.2.7溶血試驗(yàn) 將2%草酸鉀添加到新鮮采集兔血液40ml中制成抗凝兔血，然后取新鮮抗凝兔血10ml與0.9%NaCl 10ml混合稀釋。脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進(jìn)行萃取，37℃ 72h制備浸提液)10ml/管的為實(shí)驗(yàn)組，蒸餾水10ml/管作為陽性對(duì)照組及生理鹽水組10ml/管作為陰性對(duì)照組，放入37℃水浴溫箱1h后在上述3組中分別加入抗凝兔血0.2ml，每組10管，用722型分光光度計(jì)于545nm處檢測(cè)A值(取平均值)，計(jì)算溶血程度(用%表示)：溶血程度=(實(shí)驗(yàn)組A值-陰性對(duì)照組A值)/(陽性對(duì)照組A值-陰性對(duì)照組A值)×100%?？谇簧锊牧蠈?duì)溶血試驗(yàn)的要求為溶血程度<5%。

1.2.8熱原試驗(yàn) 隨機(jī)選擇至少3周內(nèi)未使用過脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料浸提液的新西蘭大白兔3只，體重2～3kg，在預(yù)測(cè)體溫前7日用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間，體重不減輕，精神、食欲、排泄等無異常現(xiàn)象，每隔30min測(cè)量體溫1次，共測(cè)量8次，每次體溫均在38.0～39.6℃的范圍內(nèi)，且最高與最低體溫相差不超過0.4℃，供熱原檢查用。試驗(yàn)用試管采用干熱滅菌法置烘箱中用250℃加熱30min去除熱原。取置于38℃恒溫水浴箱加熱1h的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)生理鹽水浸提液(按0.2g∶1ml生理鹽水的比例進(jìn)行萃取，37℃ 72h制備浸提液)緩慢注入處于安靜狀態(tài)下兔的耳緣靜脈，劑量為10ml/kg，30min測(cè)量兔體溫1次，共測(cè)量6次，取6次體溫中最高的一次減去正常體溫，為該兔體溫的升高溫度。以升高0.6℃以內(nèi)且3只兔體溫升高總和小于1.4℃為正常(當(dāng)家兔體溫升高為負(fù)值時(shí)，均以0℃計(jì))。

1.2.9掃描電鏡觀察 取接種腮腺細(xì)胞與脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料復(fù)合培養(yǎng)7d后，固定于25g/L戊二醛溶液中，0.1mol/L磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，然后用10g/L鋨酸固定，按照50%→70%→95%→無水乙醇→絕對(duì)乙醇的順序進(jìn)行乙醇梯度脫水，液態(tài)CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴鍍機(jī)鍍膜，在掃描電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用spss19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示3、5、7d的B、C組與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料對(duì)兔腮腺細(xì)胞增值無明顯抑制。

表 1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 急性毒性試驗(yàn)

分別于24、48、72h觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔，可見所有兔子神志清，精神可，活動(dòng)無異常，食欲正常，無呼吸加速及呼吸困難出現(xiàn)，大小便正常，未出現(xiàn)腹部刺激癥狀及死亡現(xiàn)象。

2.3 亞急性毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組兔喂養(yǎng)1個(gè)月，一般情況良好，精神狀態(tài)可，食欲正常，大小便正常，體重均有增加，心、肝、脾、肺、腎組織學(xué)檢查未見組織和細(xì)胞變性。

2.4 溶血試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組均無明顯溶血現(xiàn)象，陽性對(duì)照組可見全部溶血。用分光光度計(jì)檢測(cè)A值(取平均值)根據(jù)溶血程度公式計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組溶血程度為1.86%，符合口腔生物植入材料的溶血實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 熱原試驗(yàn)

注射浸提液后每間隔30min測(cè)量1次兔的肛門溫度，兔的升高溫度的最高值均小于0.6℃，體溫升高總和小于1.4℃，符合致熱原試驗(yàn)要求(見表2)。說明制備的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料所含熱原均符合生物體的要求，具有良好的生物相容性。

2.6 掃描電鏡觀察

鏡下見材料呈現(xiàn)局部放大呈現(xiàn)毛氈樣外觀，有溝、嵴及三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠原未見明顯斷裂的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；掃描電鏡觀察兔脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料表面培養(yǎng)的腮腺細(xì)胞呈類圓形或多角形，各個(gè)細(xì)胞的突觸的長(zhǎng)短、粗細(xì)以及數(shù)目各不相同，部分細(xì)胞表面可見顆粒狀突起，偶見分泌顆粒(圖1)。

表2 浸提液注射引起的體溫變化(℃)

圖1 腮腺細(xì)胞接種到脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料7d后的掃描電鏡表現(xiàn)(×600)

3 討 論

口腔中的唾液來自涎腺，具有保護(hù)和潤(rùn)滑、清潔口腔、抗菌等作用。各種原因?qū)е峦僖悍置诹繙p少致使唾液的自我清潔能力和抗菌能力減弱，患者可能會(huì)出現(xiàn)齲齒、牙周炎、咀嚼吞咽困難、口咽部感染等疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。目前治療唾液減少可以用藥物刺激具有分泌功能的殘余腺體分泌唾液，或者利用人工唾液，前者使用的藥物有副作用，而人工唾液只是暫時(shí)的替代治療。組織工程利用種子細(xì)胞附著具有生物相容性的三維支架材料來構(gòu)建具有功能的器官[4]。支架材料是組織工程研究的重要組成部分，生物支架材料作為種子細(xì)胞生長(zhǎng)的支架，種子細(xì)胞黏附于其表面，并且生物支架材料自身對(duì)培養(yǎng)的種子細(xì)胞的活性及增殖能力有影響[5-6]。

脫細(xì)胞基質(zhì)材料是一種通過人工的方法將其細(xì)胞以及可溶性蛋白質(zhì)去除的天然生物支架材料，具有無抗原、生物相容性好、不易引起感染或排斥反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，并且能為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)營(yíng)造接近體內(nèi)的培養(yǎng)生長(zhǎng)環(huán)境[7]。通過凍融聯(lián)合酶消化—冷凍干燥法制備的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)在以往的研究中[1]表明細(xì)胞成分能有效去除，具有低免疫原性 保留了利于腮腺細(xì)胞生長(zhǎng)的具有有序排列的基質(zhì)膠原，有一定的強(qiáng)度和韌性。

本文通過脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)可見浸提液組與對(duì)照組之間A值無顯著差異性，表明通過凍融聯(lián)合酶消化法制備的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料對(duì)體外培養(yǎng)的腮腺細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有毒性；全身急性毒性試驗(yàn)顯示脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料對(duì)新西蘭大白兔機(jī)體無毒性及刺激作用；通過溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，無釋放對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生破壞溶解作用的有害物質(zhì)，沒有引起急性溶血反應(yīng)；熱原試驗(yàn)表明制備的脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料所含熱原均符合生物體的要求，具有良好的生物相容性；通過掃描電鏡的觀察可見腮腺細(xì)胞附著于脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料的三維結(jié)構(gòu)上，并有外分泌顆粒生成，證明復(fù)合于脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料上的腮腺細(xì)胞是有分泌功能存在的。

本文證明脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料可以提供為腮腺細(xì)胞附著的具有生物相容性的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無毒性刺激，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，沒有釋放能引起急性溶血的有害物質(zhì)，是一種良好的生物支架材料。脫細(xì)胞腮腺基質(zhì)材料的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及胞外基質(zhì)的對(duì)復(fù)合在脫細(xì)胞處理的基質(zhì)材料表面的腮腺細(xì)胞功能的發(fā)揮是否存在密切關(guān)系，仍需與其他高分子材料以及其他生物衍生材料相比較，并對(duì)是否具有形成外分泌腺分泌涎腺的流出管道的能力，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究才能得出結(jié)論。

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